小鼠肾脏主动钙转运机制的研究

肾脏远曲小管细胞的主动钙转运由离子钙与胞浆内维生素D依赖的钙结合蛋白Calbindin D9k和Calbindin D28k结合、移动至基底膜后排出。然而，胞浆内钙的分子转运机制及Calbindins的作用大小并未完全清楚。本项目构建维生素D受体（VDR）/Calbindin D9k和Calbindin D9k/Calbindin D28k双基因剔除鼠，检测包括对照组在内七种不同基因型鼠的血尿参数值、骨质和甲状旁腺等的变化，再分离肾小管细胞，提取mRNA和蛋白质，运用基因芯片和蛋白质芯片、Real time PCR和Western杂交等技术检测相关基因mRNA和蛋白质的表达。通过组间比较分析，发现所有参与钙转运的基因和蛋白。不仅验证Calbindins的作用，并发现新的基因蛋白。从而阐明小鼠肾脏远曲小管胞浆内主动钙转运的分子机制，为骨质疏松症、佝偻病等的预防和治疗提供新的思路和途径。

一、方法：通过构建VDR SiRNA慢病毒质粒，将其转染小鼠肾小管上皮细胞，利用荧光定量检测α-SMA mRNA 表达；利用MTT法检测肾小管上皮细胞增生情况，将肾小管上皮细胞分成空白对照组、5×10-8 M 的 1,25(OH)2D3组、1×10-7 M 的PTH组、5×10-8 M 的 1,25(OH)2D3与1×10-7 M 的PTH组4组，利用基因芯片检测包括Calbindin-D9k对Calbindin-D28k、TRPV5/6、VDR、NCX1、PMCA1b在内的各组细胞全基因表达；利用免疫组化技术检测肾病综合征患儿肾组织中CaSR表达。结果：成功分离了肾小管上皮细胞，Calbindin-D9k SiRNA可有效抑制肾小管上皮细胞中Calbindin-D9k基因与蛋白表达；基因芯片结果显示：Calbindin-D9kSiRNA组与正常组相比：表达上调基因数为2567个，表达下调基因数为2568个；在TRPV5、TRPV6、Calbindin-D9k和Calbindin-D28k等维生素D依赖的靶蛋白中， Calbindin-D9k部分抑制后，仅TRPV6出现表达差异；在肾病综合征患儿肾组织中，CaSR表达增高，并与钙磷代谢紊乱、肾小管间质损害程度正相关。.二、探讨肠道肿瘤进程中维生素D与APC/β-catenin的信号通路之间的交互关系。合并维生素D受体失活的APCmin/+小鼠通过交配传代获得，比较不同年纪大小的APCmin/+和APCmin/+VDR-/-小鼠肠道肿瘤的发生、发展情况，3,4,6,7月龄的两组小鼠的小肠和结肠肿瘤的数目无明显差异，然而，所有年纪APCmin/+VDR-/-小鼠肿瘤的大小明显增加。免疫染色显示APCmin/+VDR-/-小鼠肠道肿瘤的β-catenin, cyclin D1, 磷酸化的Stat-3和MSH-2表达明显增强，而Stat-1表达降低。这些数据显示VDR信号通路抑制肠道肿瘤的生长而不是其发生，APCmin/+VDR-/-小鼠肠道肿瘤增长的势头似乎是由于VDR生长抑制作用的丧失引起。