茶树中EGCG-O-甲基转移酶基因的转录调控机制研究

O-methylated catechins are the most important secondary metabolites in tea plant (Camellia sinensis). Catechins-O-methyltransferase (EGCG- O-methyltransferase, ECG- O-methyltransferase, EGC- O-methyltransferase) is the key enzyme to synthesize O-methylated catechins. The function and transcriptional regulation mechanism of Catechins-O- methyltransferase is largely unknown due to the scarce tea resources with high O-methylated catechin content. The effects of EGCG-O-methyltransferase (CsOMT) in gene, protein and enzyme levels on the synthesis O-methylated EGCG were studied using different cultivar leaves with high O-methylated EGCG content. The promoter sequence of CsOMT gene was cloned by genome walking. Transcription factors that regulate CsOMT gene were obtained by Yeast one hybrid library screening, and further identified by electrophoretic mobility shift and effector-reporter assays. Three or four key transcription factors were selected and their functions were verified by RNA interference in tea plant. These results will elucidate the transcriptional regulation mechanism of CsOMT which provide theoretical support for innovation of tea cultivar resources with high O-methylated EGCG content.

甲基化儿茶素是茶树重要的次生代谢产物，儿茶素-O-甲基转移酶(EGCG-O-甲基转移酶, ECG-O-甲基转移酶, EGC-O-甲基转移酶)是各种甲基化儿茶素合成中的关键酶。由于富含甲基化儿茶素的茶树资源稀少，甲基化儿茶素的生物合成关键酶基因的功能及其转录调控机理尚未明晰。本项目拟以前期研究获得的富含甲基化EGCG的茶树资源为材料，研究EGCG-O-甲基转移酶(CsOMT)在基因、蛋白和酶活性水平对甲基化EGCG合成的影响；进一步克隆CsOMT基因的启动子，采用酵母单杂筛库、凝胶阻滞分析和体内瞬时表达等DNA-蛋白质互作技术筛选、鉴定调控CsOMT基因的关键转录因子；同时挑选3-4个关键转录因子在茶树中进行RNA干扰，明确其在甲基化EGCG生物合成的具体功能，最终阐明甲基化EGCG生物合成关键酶基因CsOMT的转录调控机制，为高甲基化EGCG的茶树种质资源创新提供理论依据。

本研究采用同源克隆法成功获得了茶树CsCOMT的cDNA全长序列。通过原核表达得到的重组酶CsCOMT可催化EGCG合成EGCG″3Me。应用qRT-PCR技术，研究了甲基化EGCG合成相关基因在不同茶树品种、不同季节和茶树鲜叶不同发育阶段中的表达情况。克隆了EGCG3"Me生物合成相关基因CsLAR, CsDFR和CsCOMT的启动子序列。启动子包含了TATA框、CAAT等启动子最基本的作用元件，以及其他许多重要的顺式作用元件如光反应元件、逆境反应元件及MYB、MYC和WRKY等转录因子的结合元件。克隆了2个“JMD vs FD”和“JGY vs FD” 间下调的WRKY基因CsWRKY31和CsWRKY48。特性分析表明CsWRKY31和CsWRKY48为核蛋白且均无转录激活活性，是转录抑制子。通过凝胶阻滞迁移实验（EMSA）发现CsWRKY31和CsWRKY48的重组蛋白可以直接结合CsLAR, CsDFR和CsCOMT启动子区域的W-box (C/T)TGAC(T/C)元件；双荧光素酶报告系统实验（DLR）显示，CsWRKY31和CsWRKY48可以抑制CsLAR, CsDFR和CsCOMT启动子的活性。克隆了1个“JMD vs FD”和“JGY vs FD” 间上调的WRKY基因CsWRKY57like。EMSA 和Chip-qPCR结果显示，CsWRKY57like可以结合含有W-box (C/T)TGAC(T/C)元件的CsLAR, CsDFR和CsCOMT启动子，双荧光素酶瞬时表达分析表明CsWRKY57like和CsWRKY65可以激活CsLAR, CsDFR和CsCOMT的启动子活性。克隆了茶树基因组VQ家族7个基因。CsWRKY48与CsVQ10和CsVQlike2之间存在蛋白相互作用关系, CsWRKY57like与CsVQ4存在互作关系。酵母自激活分析表明CsVQlike2具有转录激活活性，CsVQ4和CsVQ10没有激活活性。本研究通过分析调控EGCG3"Me生物合成的可能因素和机制，对于提高茶树中EGCG3"Me的含量具有重要的理论指导意义，以为高EGCG3"Me茶树品种选育提供理论依据，进一步推动特异性茶树种质资源的开发和利用。