水稻白叶枯菌与细菌性条斑菌鞭毛蛋白诱导防卫反应的研究

分子植物病理学的发展赋予水平抗性新涵义。通过识别病原相关分子模式（PAMP），植物可启动防卫反应，增强自身的水平抗性。细菌鞭毛蛋白作为一类植物所识别的PAMP，其诱导的防卫反应在水平抗性育种中的应用潜力值得深入探讨。本研究将敲除水稻白叶枯菌(Xoo)和细菌性条斑菌(Xooc) 鞭毛蛋白基因，研究鞭毛对这两种细菌致病力的影响；从多种Xoo和Xooc菌株中克隆鞭毛蛋白基因，选择有代表性的在大肠杆菌中表达并分离纯化，或直接从细菌活体中分离鞭毛蛋白，测试其诱导水稻防卫反应的能力；另将构建拟南芥AtFLS2、水稻OsFLS2、以及两基因的区域置换表达载体，将其分别导入水稻与拟南芥fls2突变体中，测试转基因植株对鞭毛蛋白的识别能力，比较水稻与拟南芥感知鞭毛蛋白分子机理；最后，尝试用化学和病原菌诱导表达载体,在水稻中适时表达能诱导防卫反应的鞭毛蛋白，增强水稻的广谱抗病性,寻求水稻水平抗性育种新途径。

在双子叶植物拟南芥中，FLS2是细胞膜上受体类激酶蛋白，能感知病原细菌的鞭毛蛋白并激活植物本身的防卫反应，抵御细菌的侵染达到抗病的效果。但是，在单子叶禾本科作物水稻上有关受体类激酶OsFLS2与鞭毛蛋白互作的研究较少。水稻能否识别两种最重要的病原细菌，白叶枯菌Xanthomonas oryzae pv. oryzae (Xoo)和细菌性条斑菌Xanthomonas oryzae pv. oryzicola (Xoc)的鞭毛蛋白而激活抗病反应，至今仍然未知。本研究从以下几个方面开展了水稻OsFLS2与其病原细菌鞭毛蛋白间相互作用的研究。首先，从15个Xoo和3个Xoc 菌株中克隆到鞭毛蛋白基因fliC，序列分析表明，Xoo和Xoc鞭毛蛋白氨基酸序列多态性低；随后，在大肠杆菌中离体表达并分离纯化Xoo、Xoc和水稻褐条病菌（Acidovorax avenae）的鞭毛蛋白。通过幼苗生长抑制、氧爆发实验以及PR基因表达分析，发现只有Aa的鞭毛蛋白能在拟南芥与水稻中诱导防卫反应而Xoo和Xoc的鞭毛蛋白没有诱导能力；第三，通过同源重组，敲除了Xoo与Xoc的鞭毛蛋白基因fliC与Xoc可能的糖基转移酶基因rbfC，分析了这些基因缺失体的致病相关表型与致病力。通过Western分析，确认RbfC参与鞭毛蛋白的糖基化，但其糖基化缺陷并不影响其游动性与致病力，而且鞭毛的丧失也不会影响Xoo和Xoc细菌的致病力；第四，构建了拟南芥AtFLS2与水稻OsFLS2的系列表达载体，分别导入水稻与拟南芥fls2突变体中，获得OsFLS2不同表达量的转基因株系。测试不同转基因植株对flg22的识别能力，发现OsFLS2对flg22的识别依赖于其表达量；最后，纯化了Xoo/Xoc鞭毛蛋白（不能被OsFLS2识别）与Aa鞭毛蛋白（能被OsFLS2识别）间区域置换（domain swapping）蛋白。检测了水稻与转基因拟南芥株系对这些区域置换蛋白的识别能力，分析了水稻识别鞭毛蛋白的特异区域。根据以上研究结果，确定水稻OsFLS2能够识别Aa鞭毛蛋白但不能识别Xoo和Xoc鞭毛蛋白；虽然OsFLS2和AtFLS2一样都只特异性识别鞭毛蛋白的flg22区域，但它对flg22的亲和力比AtFLS2低。这些结果将为FLS2介导的抗性应用于水稻抗病育种提供有用的信息。