悬浮细胞中岩黄连碱对诱导子壳聚糖的响应机制研究

Corydalis saxicola Bunting is a vital Yao Zhuang folk medicine, its active medicinal component dehydrocavidine is crucial for live cancer therapy, but its yield is very low. Researchers tried to increase the yield of the dehydrocavidine in the suspension cells by adding elicitors, but little is known about its regulation mechanism. Based on the previous establishment of tissue culture and rapid propagation system for Corydalis saxicola Bunting, this project aims to build its optimal suspension cell lines, and to analyze the relationship of dehydrocavidine accumulation and the chitosan elicitors addition time and amount. By using Corydalis saxicola Bunting Callus material and plant cell culture technology, the physiological and biochemical indexes of chitosan elicitor induced changes of related soluble sugars, proteins, enzymes, and amino acids will be analyzed, as well as the changes of alkaloids synthesis Cs(S)-THBO gene expression. To sum up, we try to speculate the molecular response mechanism of Corydalis saxicola Bunting to chitosan elicitor, and to lay a foundation for large scale cell culture production of dehydrocavidine.

岩黄连（Corydalis saxicola Bunting）是著名的壮瑶民族药，其活性成分岩黄连碱对肝癌治疗具有奇效，但岩黄连碱含量极低，研究者曾试图通过添加诱导子来提高悬浮细胞中岩黄连碱的产量，但是诱导子调控细胞合成机制并不清晰。本项目旨在在申请者前期完成岩黄连组培快繁体系基础上，建立岩黄连优良悬浮细胞系，分析悬浮细胞中岩黄连碱积累与壳聚糖的添加时间和添加量的关系。通过采用植物细胞培养技术，以岩黄连愈伤组织为材料，分析壳聚糖诱导子加入后相关的可溶性糖、蛋白质、相关酶、氨基酸等生理生化指标及生物碱类合成调控基因Cs(S)-THBO表达量变化。总之，通过该研究我们试图阐明岩黄连碱对壳聚糖诱导子的分子响应机制，为大规模细胞培养生产岩黄连碱奠定基础。

岩黄连（Corydalis saxicola Bunting）是中国喀斯特地区特有药用植物，是珍稀濒危的壮瑶民族药，其活性成分岩黄连碱对肝癌治疗具有奇效，但生境特殊、自然繁殖率低、人工繁育不成规模等原因限制其开发利用，而岩黄连碱含量极低，本研究旨在通过在悬浮细胞中添加诱导子调控岩黄连碱的合成，以期为大规模细胞培养生产岩黄连碱奠定基础。项目在前期完成岩黄连组培快繁体系基础上，选择岩黄连无菌苗根、茎、叶等不同外植体诱导愈伤组织，筛选愈伤组织诱导的培养基类型和激素组合，应用石蜡切片法和组织化学定位法对愈伤组织岩黄连碱定性观察，并通过高效液相色谱法对岩黄连碱进行定量检测，筛选建立最优的愈伤组织体系，继代并明确诱导悬浮细胞的培养基类型及激素配比，建立岩黄连悬浮细胞系，并在悬浮细胞不同培养时期添加诱导子壳聚糖，测定诱导子对细胞生长及活性影响，用紫外分光光度法检测诱导子对悬浮细胞中POD、SOD等生理指标，对比悬浮细胞的岩黄连碱含量，及悬浮细胞中基因Cs(S)-THBO进行表达量差异。结果表明：愈伤组织诱导效果最佳部位是叶片，最佳的诱导培养基是B5+0.5mg/l2,4-D+1mg/l6-BA,组织化学定位结果显示岩黄连碱主要位于叶片愈伤组织结节部位；培养30d时愈伤较疏松且分散性好，岩黄连碱含量为0.197%，此愈伤组织经继代筛选建立岩黄连细胞系，诱导培养基为B5+1.0mg/l2,4-D+0.5mg/l6-BA，细胞经稳定培养10代后添加壳聚糖，当细胞在培养3d加入2g/l壳聚糖时，所得细胞生物量最高，为16.5g/l，比对照组高15%；而生理指标结果也表明添加壳聚糖后SOD、POD、CAT、MDA等均显著高于对照组；岩黄连碱含量比较研究结果显示，当培养3d添加浓度为3g/l的壳聚糖时，岩黄连碱含量最高达到0.54%，约是对照组的2.4倍，此时，基因Cs(S)-THBO表达较对照组上调近2倍。本研究表明壳聚糖能有效提高岩黄连悬浮细胞中生物碱含量，为生物合成抗肝癌有效成分岩黄连碱基础。