环二腺苷酸调控膜蛋白酶HtrA促进莱姆病螺旋体在哺乳动物中感染的机制

Borrelia burgdorferi (Bb) is the causative agent of Lyme disease, the most important tick-borne disease. Cyclic di-AMP is a newly discovered bacterial second messenger, mostly found in Gram-positive bacteria. The mechanism of c-di-AMP signaling is poorly known. We discovered that 1) the Gram-negative bacterium B. burgdorferi also produces c-di-AMP, and its presence is essential for mammalian infection; 2) c-di-AMP binds to HtrA, a surface serine protease that is known to bind and degrade the host cell matrix molecule aggrecan. We hypothesize that c-di-AMP interacts with HtrA and modulates its function, and plays an important role in mammalian infection. We will employ the c-di-AMP mutant and htrA mutant and use biochemical, genetic, transcriptome, and animal model approaches, to elucidate the mechanism of c-di-AMP and HtrA during infection. Outcome will not only improve our understanding in Lyme disease pathogenesis, but also reveal new mechanism of c-di-AMP signaling in bacteria in general.

莱姆病是由伯氏疏螺旋体（B. burgdorferi, Bb）引起，经蜱传播的媒介传染病。c-di-AMP是新近在革兰阳性菌中发现的微生物第二信使，其具体作用机理仍未明。我们发现：1）革兰阴性菌Bb也合成c-di-AMP，并是感染哺乳动物所必需；2）c-di-AMP能与Bb膜表面蛋白酶HtrA相互作用。HtrA能结合并降解宿主细胞外主要基质-蛋白聚糖（Aggrecan）。因此，我们提出假说：c-di-AMP是Bb感染哺乳动物所必需，HtrA是新的c-di-AMP作用靶点；c-di-AMP通过调控HtrA和其他靶点的功能，来促进Bb感染哺乳动物并致病。我们拟利用c-di-AMP合成酶基因和htrA基因缺陷株、互补株和纯化的蛋白，从生化、遗传学、转录组学水平和动物感染试验，探讨c-di-AMP调控HtrA促进莱姆病螺旋体感染力的分子机制，并为研究c-di-AMP第二信使提供新思路。

莱姆病是由伯氏疏螺旋体（Borrelia burgdorferi）引起的媒介传染病，其确诊的病例遍及我国29个省（市、区）。对B. burgdorferi致病性以及致病机制的研究，将为B. burgdorferi感染防控策略的制定提供理论依据。环二腺苷酸 c-di-AMP为微生物重要第二信使，从2008年首次在枯草芽孢杆菌中被发现到2013年，c-di-AMP 在微生物中的作用引起高度关注，陆续被证明其参与微生物重要生理功能的调控，包括调控细胞形态、K+通道蛋白活性、抗生素抗性以及引起免疫反应等。但对c-di-AMP发挥作用的分子机制，尤其是 c-di-AMP 在细菌中靶点的研究知之甚少。申请人在申请本项目前期（2014年），预测出B. burgdorferi中唯一一个编码c-di-AMP的合成酶基因bb0008，构建了bb0008敲除株，发现bb0008的敲除株不能感染小鼠，说明c-di-AMP是B. burgdorferi重要的毒力因子。进一步通过c-di-AMP与蛋白共沉淀试验，发现金属蛋白酶Bb0104（HtrA）能与c-di-AMP结合，推测c-di-AMP通过作用HtrA影响其致病力。依托本项目的资助，申请人开展了系统性、连续性、深入性的研究，通过蛋白纯化和酶学试验，证明BB0008能够合成c-di-AMP，是B. burgdorferi中c-di-AMP的合成酶；构建了hrtA敲除、回补株，通过小鼠腹腔感染试验，发现htrA敲除株也失去对小鼠的感染力，证明HtrA是B. burgdorferi的重要毒力因子；进一步通过蛋白纯化和酶动力学试验，发现HtrA能够水解重要毒力因子BB0323，经HtrA切除后的BB0323被激活，发挥其毒力功能；通过c-di-AMP与HtrA全长、N端和C端蛋白的结合实验以及结合后HtrA酶活性的测定，发现HtrA与c-diAMP的结合域位于其N端，其C端为PDZ水解酶活性中心，c-di-AMP与HtrA结合后，可增强HtrA的C端水解酶活性。因此，本项目揭晓了c-di-AMP通过调控HtrA促进莱姆病螺旋体在哺乳动物中感染的机制，顺利并超额完成项目书中的内容和目标，研究成果为c-di-AMP在其他菌中的研究提供新思路。依托以上研究成果，申请人以第一作者在领域主流期刊发表SCI论文2篇，获得省部级科学技术进步奖二等奖1项。