原肌球调节蛋白1在血管平滑肌细胞迁移中的作用及机制研究

原肌球调节蛋白1（Tmod1）是肌动蛋白的盖帽蛋白，被证明存在于平滑肌细胞的细胞骨架中，但它在血管平滑肌细胞（VSMC）中的作用还未见报导。预实验结果表明，Tmod1在PDGF处理的VSMC中表达增加，敲低Tmod1可显著抑制PDGF诱导的VSMC迁移及细胞骨架中应力纤维的形成。据此提出的假说是：Tmod1 通过调节应力纤维的组装和粘着斑的形成来促进VSMC的迁移，从而在新生内膜形成中发挥作用。为验证假说，我们将建立大鼠颈动脉球囊拉伤模型，检测Tmod1在新生内膜中的表达变化；利用原代培养的主动脉平滑肌细胞，检测Tmod1在不同细胞因子和生长因子作用下的表达及其调控；利用腺病毒和小RNA干扰技术，研究Tmod1对细胞中应力纤维组装、粘着斑形成及细胞迁移能力的影响。本研究将加深我们对VSMC迁移的分子基础的理解，并为研制和开发更有效的防治血管再狭窄和动脉粥样硬化斑块形成的方法奠定基础。

血管内膜新生所导致的管腔再狭窄是血管成形术治疗失败的主要原因。血管平滑肌细胞从中膜向内膜的迁移和增殖是新生内膜形成中的重要事件，而以肌动蛋白为基础的细胞骨架的重构是平滑肌细胞迁移过程中的关键步骤。本课题研究肌动蛋白的盖帽蛋白--原肌球调节蛋白1（Tmod1）在血管平滑肌细胞迁移中的作用及其机制。蛋白免疫印迹实验表明，Tmod1在血管的中膜组织有高表达。在平滑肌细胞中表达Tmod1-GFP融合蛋白后发现，Tmod1定位于胞浆和应力纤维中。在球囊拉伤的大鼠颈动脉模型中，发现在拉伤14天的颈动脉中Tmod1的蛋白表达水平显著升高。免疫组织化学结果显示，Tmod1定位于14天新生内膜的平滑肌细胞中。在体外细胞实验中， PDGF-BB处理能引起Tmod1转录水平的上调，而TGF-beta的处理能导致Tmod1的下调。与之相一致，荧光素酶活性分析显示，Tmod1启动子的活性能被PDGF-BB显著上调，而被TGF-beta显著下调。利用腺病毒感染在平滑肌细胞中过表达Tmod1，通过Boyden小室分析和MTT分析发现Tmod1能促进细胞的迁移、粘附、伸展和增殖；蛋白免疫印迹显示，Tmod1过表达引起平滑肌收缩表型标志物SMaA、Calponin和SM22a的表达下降，并促进粘着斑蛋白paxillin的表达和磷酸化水平；激光共聚焦显微镜观察发现Tmod1促进细胞内应力纤维的形成。与之相反，Tmod1的敲除能抑制细胞的迁移、粘附和增殖，引起SMaA的上调，paxillin和FAK的下调。利用siRNA敲低Tmod1能引起应力纤维的减少。蛋白免疫印迹结果显示，平滑肌细胞中Tmod1的表达能被Rho激酶抑制剂Y-27632所上调。本研究的结果表明，Tmod1通过改变粘着斑和应力纤维的组装以及平滑肌细胞的表型来促进平滑肌细胞的迁移和增殖。这为新生内膜形成提供了一个新的机制，Tmod1也可能成为预防血管再狭窄的一个新靶点。