PIF1解螺旋酶在双链DNA断裂损伤修复中的作用及分子机制研究

PIF1解螺旋酶家族在生物体内具有很多重要的生理作用。前期研究中我们发现PIF1蛋白的N-末端具有一定的保守性，将其命名为PINT功能域，并证明了PINT功能域具有使DNA单链退火形成双链的性质。研究还发现PIF1蛋白具有依赖ATP、GTP、UTP、CTP的解链活性，从而推测PIF1蛋白具有单链DNA交换活性，参与DNA双链断裂（DSBs）损伤的同源重组修复，本实验拟建立DSBs的同源重组修复（HR-DSBs）模型的HeLa细胞系，利用RNA干扰技术抑制PIF1蛋白表达，建立PIF1蛋白抑制表达的HR-DSBs-Hela细胞系，进行绿荧光蛋白定量强度检测，确定PIF1蛋白对DSBs的同源重组修复作用。同时纯化无tag的PIF蛋白检测其单链DNA交换反应，从分子水平阐述PIF1作用机制。PIF1蛋白作为新的DSBs同源重组修复蛋白，可能为包括肿瘤在内的多种人类疾病提供新的治疗靶点。

PIF1解螺旋酶家族在生物体内具有很多重要的生理作用。前期研究中我们发现PIF1蛋白的N-末端具有一定的保守性，将其命名为PINT功能域，并证明了PINT功能域具有使DNA单链退火形成双链的性质，并推测PIF1蛋白具有单链DNA交换活性，参与DNA双链断裂（DSBs）损伤的同源重组修复。.本实验拟建立DSBs的同源重组修复（HR-DSBs）模型的U2OS细胞系，利用RNA干扰技术抑制PIF1蛋白表达，建立PIF1蛋白抑制表达的HR-DSBs-U2OS细胞系，进行绿荧光蛋白定量强度检测，确定PIF1蛋白对DSBs的同源重组修复的作用。利用纯化的PIF蛋白检测其单链DNA交换反应，从分子水平阐述PIF1作用机制。.课题首先发现人PIF1敲低细胞，经阿霉素处理细胞存活率下降，4Gy γ射线照射后，彗星电泳实验证实拖尾明显，提示人PIF1参与DNA双链断裂修复。随后建立DSBs的同源重组修复（HR-DSBs）模型的U2OS细胞系，证实了人PIF1参与DNA双链断裂的同源重组修复。同时还发现人PIF1抑制电离辐射诱导的DNA凋亡。此外我们还发现PIF1的PINT功能域有新功能：① PINT功能域对其同源重组修复是必须的，其缺失会使其修复能力大大下降。② PIF1的核定位序列位于PIF1的PINT功能域，对PIF1蛋白入核非常关键。单独PINT结构域就能入核，其缺失导致PIF1蛋白弥散于整个细胞中。PIF1蛋白作为新的DSBs同源重组修复蛋白，可能为包括肿瘤在内的多种人类疾病提供新的治疗靶点。