基于荧光共振能量转移技术的生物材料诱导干细胞定向分化的FAK/Src信号传导机制研究

The tissue inductivity of biomaterials is the basis of tissue engineering that can be achieved, but how materials science signal controls stem cells directional differentiation along specific organization cell lines, and then induces tissue and organ repair and regeneration is a lack of understanding from living cells at the molecular level. So the biomaterial tissue induction mechanism is unclear. Our group's early studies have confirmed that the quantitative relationship exists between the biomaterials science signal and molecular signaling protein activity of the focal adhesion kinase (FAK) and non-receptor tyrosine protein kinase(Src) in living cell by using fluorescence resonance energy transfer (FRET) technique, but the signal transmission pathway has not yet proven. In this research project, high-throughput screening systems are intended to prepare biomaterials array with special composition and performance characteristics, and combine with FRET technique timely dynamic observation, quantitative analysis of the spatial and temporal effects of signaling protein activity and distribution within living marrow mesenchymal stem cells (MSCs) under the stimulus of different materials science signal. This subject further discusses the signal transmission pathway of MSCs directional differentiation by means of the materials science signal, and reveals the possible mechanism of FAK/Src during MSCs directional differentiation from the living cells at the molecular level based on the relationship between materials science signal, protein and protein. This project not only can help to elucidate the molecular mechanism of biomaterial tissue inductivity, but also provides theoretical basis for optimal design of biomaterials.

生物材料的组织诱导性是组织工程得以实现的基础，但材料学信号如何调控干细胞沿特定组织细胞系定向分化，进而诱导组织与器官的修复与再生，缺乏从活细胞分子水平上的认识，其组织诱导机制尚未阐明。在前期研究中，申请人初步证实材料学信号与活细胞分子信号蛋白粘着斑激酶(FAK)以及非受体络氨酸蛋白激酶（Src）活性之间存在定量关系，但其信号传导途径还未探明。本项目拟采用高通量筛选系统制备具有特定组成及性能特征的生物材料阵列，结合荧光共振能量转移（FRET）新技术，在活细胞实时动态观察并定量分析材料学信号刺激下，骨髓间充质干细胞内FAK/Src及相关信号蛋白活性与分布的时空效应，探讨影响干细胞分化的材料学信号传导途径，从材料学信号诱导以及蛋白-蛋白相互作用的角度揭示FAK/Src在干细胞分化调节中的可能机制。本项目的开展，不但有助于深入阐明生物材料组织诱导性的分子机制，还将为生物材料的优化设计提供理论依据。

由于外伤、肿瘤、炎症以及社会老龄化所造成的组织或器官缺损严重威胁人类健康，具有组织诱导功能的生物材料在临床上具有重大的潜在应用，成为当代生物材料领域研究的重点和前沿课题。大量实验研究已经证实一定组成和结构的生物材料能够诱导某些组织再生，生物材料组织诱导概念已为人们所认识和接受。理想的生物材料除了能为干细胞提供良好的聚集和黏附界面并促进其增殖外，最重要的是其材料学信号可为干细胞所感受，并转导为细胞内特定的分子信号，使其在空间和时间上程序化表达，从而调控干细胞沿特定组织细胞系定向分化，最终形成有生理功能的组织或器官。但材料学信号如何调控干细胞沿特定组织细胞系定向分化，进而诱导组织与器官的修复与再生，缺乏从活细胞分子水平上的认识，其组织诱导机制尚未阐明。.本项目借助FRET技术研究了在成骨、成肌以及成神经等诱导剂的作用下，人骨髓间充质干细胞的分化过程中FAK和Src活性变化。结果表明，细胞膜上的FAK和Src活性受成骨诱导剂而明显上调；成肌诱导剂只上调Src而非FAK；成神经诱导剂会短暂地先上调FAK活性随后上调Src，随即会负向抑制FAK活性。这些结果明显地解释了在干细胞分化过程中，FAK和Src活性的变化，有助于我们了解在组织工程中干细胞分化的机制。我们采用相分离、冷冻干燥、微波烧结等工艺制备了一系列纳米结构钙磷微球，通过体内外实验证实了纳米陶瓷更有利于诱导成骨，同时利用FRET技术，我们观察到表面纳米结构诱导细胞FAK和Src活性极性分布，细胞分化速度与能力增强。随后，我们利用印章技术制备微图案，观察到了细胞在边界生长的边界力学生物学效应。通过本项目的开展，我们发展了FRET活细胞影像技术在组织工程诱导分子机制方面的研究，试图通过构建组织诱导微环境认识生物材料对活细胞关键分子蛋白的活性及分布变化规律的影响。在实验实施过程中，项目组共发表论文14篇，其中SCI检索论文8篇，EI4篇，CSCD收录论文2篇，出版专著1部、编著1部，授权发明专利16项，较好完成了项目预定目标。