大豆氮利用相关基因Gmduf-cbs的功能解析

Soybean is the world's most widely planted legumes. Nitrogen is an important macronutrients required for plant growth and a limiting factor for crop productivity. As a legume, soybean can acquire N for its growth via its N-fixing symbiosis with rhizobacteria, which form nodules on the roots and can fix atmospheric N. In addition, soybean can draw mineral nitrogen from the soil. These processes may not supply enough N for soybeans to maximize yield, especially in high-yield environments. The low efficient use of nitrogen fertilizer not only directly affects yields and quality of soybean products, but also causes environmental pollution. Improving the nitrogen-use efficiency (NUE) is therefore crucial. At present, the NUE mechanism is unclear and the information on genes associated with NUE is lack in soybean. The study based on modern molecular biology and transgenic technology, and combined with a new generation of high-throughput sequencing technology. A candidate gene Gmduf-cbs for NUE was identified and analysis. The gene encoding protein contain DUF and CBS domain. A number of cystathionine β-synthase (CBS) domain containing proteins (CDCPs) in Arabidopsis thaliana and Oryza sativa clearly established their stress and developmental regulation, thereby implicating their importance in plants. Thus CDCPs may also have related function under nutritional stress. In this study, the ORF and promoter of Gmduf-cbs will be isolated. The molecular function of Gmduf-cbs involved in the high NUE will be estimated through overexpression, RNAi and compensate analysis in Arabidopsis mutant. This will provide a detailed understanding of NUE mechanisms and also provide a basis for breeding soybean varieties that are tolerant to low nitrogen condition..

大豆是世界上最广泛种植的豆科植物。氮素是限制植物生长和产量形成的首要因素。大豆虽然是固氮植物，但其自身所固定的氮不能满足大豆丰产对氮素的需求。氮肥的低效利用造成环境污染和经济损失。因此，提高大豆氮素利用效率是关键。目前大豆氮高效利用的分子机理尚不明确，相关的基因信息也十分有限。通过前期大豆氮高效品种及氮敏感品种的筛选以及数字基因表达谱的测定，筛选出了一个氮高效相关的候选基因Gmduf-cbs，该基因编码的蛋白带有DUF和CBS结构域。在植物中，许多拟南芥和水稻中的未知功能的CBS结构域蛋白成员与抵御非生物胁迫有关，推测该家族在植物抵抗生物与非生物胁迫反应中有重要作用。由此推测CBS结构域基因在营养胁迫条件下也可能具有相关功能。因此，本实验拟在此基础上，克隆该基因及其启动子，通过基因超量表达、抑制表达以及突变体回补等方法对其功能进行分析，为揭示大豆氮高效利用分子机制以及分子育种提供依据。

提高氮吸收与利用效率对提高大豆产量、降低大豆生产成本、保护环境均具有十分重要意义。虽然目前对大豆氮吸收与利用的分子机理研究很多，但探索氮吸收与利用新途径，可为培育氮高效利用大豆品种提供理论依据。本研究在前期筛选大豆氮高效品种和氮敏感品种、不同氮处理条件下数字基因表达谱的测定，筛选出一个氮高效相关的候选基因GmCBS21基础上，对该基因进行生物信息学分析、功能分析，并通过酵母双杂交，筛选该基因互作蛋白，为探明该基因作用机理奠定基础。研究结果如下：. 系统分析鉴定了71 个大豆CBS家族基因。根据基因结构及系统进化分析将其分成9个亚组，基因定位表明，20 条染色体中的 18 条均有CBS 基因，该基因家族的分布具有广泛性。通过保守结构域分析，GmCBS21是一个不同于已知功能的含有CBS结构域的基因。. 克隆GmCBS21基因及其启动子，对其表达特点及功能进行分析。GmCBS21蛋白在植物各个组织及器官中均有表达，定位在质膜上，属于一种膜蛋白。GmCBS21蛋白虽然含有cystathionine β-synthase结构域，但并不具有cystathionine β-synthase酶的活性，并不属于cystathionine β-synthase类蛋白。.超量表达GmCBS21基因可以提高大豆的氮利用效率，在氮胁迫条件下，与非转基因植株相比产量有所提高。同时GmCBS21基因RNAi干涉拟南芥植株降低了低氮耐受性，进一步证实了该基因的耐低氮功能。.为了探究GmCBS21基因提高植物耐低氮机理，对转GmCBS21基因拟南芥和野生型拟南芥进行RNA-seq分析，通过差异表达基因分析，在低氮诱导条件下，转基因植株在已知的氮利用相关基因，转录因子，蛋白激酶以及光合作用相关的一些基因特异表达，而在野生型植株中无差异，从而推断，GmCBS21基因提高低氮耐受性可能通过调控这些基因来实现。.通过酵母双杂交筛选与GmCBS21互作蛋白，来探明GmCBS21调控机理，初步筛选出40个候选基因，包括参与光合作用，转录调节，能量代谢、蛋白修饰、防御和信号转导等途径，有待通过进一步验证来确认互作蛋白，进一步探明基因调控网络。