苯唑西林杀死MRSA43300的“双相”机制及细菌凋亡相关蛋白的研究

Although b-lactam antibiotics have long been used clinically, their mechanism for killing bacteria is so far unknown. To solve this scientific topic, many questions have to be answered, which include how PBPs-targeting b-lactam antibiotics can kill bacterial being in stationary phase, if apoptosis is related to breaking cell wall via activation of cytohydrolist by these antibiotics, and if liking eukaryote, bacterium apoptosis induced by these antibiotics needs association of apoptosis-inducing factors. . We studied the effect of oxacillin against MRSA 43300 and some interesting results were obtained via drawing the time course of cell death, observing morphological changes via electron microscope, and proteomics approaches. The present project aims to study if the early-stage cell death of MRSA 43300 induced by b-lactam antibiotics is only an apoptosis process, while late-stage cell death is associated with both apoptosis and activation of cytohydrolist. Our previous study showed that oxacillin dramatically upregulated the expression of 30 S ribosomal protein S7 and phosphoglycerate kinase, thus herein we will document that if these two protein play crucial roles in inducible apoptosis. In summary, this study will benefit understanding action mechanism of b-lactam antibiotics and provide insight into discovery of new targets of antibiotics.

至今的研究，还不能科学地解答β-内酰胺抗生素的杀菌机制：作用于PBPs的这类抗生素为何能杀死静止期的细菌？该类抗生素诱导的细胞壁水解酶引起的细胞壁破裂死亡，与诱导的细菌凋亡之间有何联系？细菌凋亡是否与真核细胞一样存在有“凋亡蛋白”？. 本研究基于申请者前期苯唑西林对MRSA 43300的“时间-杀菌曲线”、“电镜观察”和“蛋白组学”的研究结果，结合已有的文献，研究苯唑西林杀死MRSA 43300过程中，是否前期死亡主要是 “凋亡”所致；而后期死亡既有“凋亡”，也有 “细胞壁水解酶”所致，即“双相”机制？另外，研究在前期细菌非细胞裂解死亡的过程中，被苯唑西林诱导高表达的30S核糖体蛋白S7和磷酸甘油酸酯激酶，是否是引起凋亡的“关键蛋白”？本研究，对完善或建立新的β-内酰胺抗生素的杀菌机制，具有重要的理论意义。也对发现新的抗生素作用靶标提出了新的思路，具有重要的应用指导意义。

金黄色葡萄球菌是临床上常见的条件性致病菌，常引起术后皮肤或软组织感染，其中耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）对常用的抗菌药物的耐药率远远高于甲氧西林敏感菌株（MSSA），且在国内临床检出率高达 35%以上，因此 MRSA 感染成功公共卫生安全重要问题之一。当前临床上用于金黄色葡萄球菌治疗的首选抗生素依旧是 β-内酰胺抗生素。虽然对于β-内酰胺抗生素的杀菌机制有许多研究，但仍然有许多无法解释的问题。前期我们对 20 倍 MIC 苯唑西林处理的 MRSA 菌株进行了蛋白组学测定，确定了作用0.5 h和 1 h上调的蛋白，猜测这些蛋白可能在β-内酰胺抗生素杀菌过程中起一定作用。目前用于金黄色葡萄球菌的基因编辑方法较繁琐，且成功率低。我们基于近来研究较多的CRISPR-Cas9系统建立了金黄色葡萄球菌的基因编辑工具，大大的减少了操作步骤，且提高了成功率。我们再利用基因编辑技术对蛋白组学上调蛋白的基因进行敲除，之后对这些敲除株进行生物特性研究来确定这些基因在苯唑西林杀菌过程中作用。我们成功获得了MRSA菌株的tgt、cdr、ezrA、ebpS、metG、 rlmN、ltaS 5个基因的敲除株，并发现tgt敲除抑制agr基因座的表达提高生物膜的形成；在较低浓度苯唑西林作用下，cdr 基因缺失降低胞内活性氧水平，减小杀菌速率，延缓次级损伤效应；ezrA缺失将显著降低苯唑西林及其他作用细胞壁抗生素的MIC，增大细菌自溶能力从而提高生物膜生成，这些可能与其上调细胞壁水解酶及自溶酶基因表达相关；ebpS基因不影响苯唑西林对ATCC43300菌株的抑菌浓度，但显著影响苯唑西林对ATCC43300的杀菌速率；研究确定ezrA、ebpS基因对维持细菌细胞壁的稳定非常重要，它们的敲除株能显著增大MRSA菌株对苯唑西林的敏感性。虽我们并没有发现细菌凋亡的现象，但我们已有的数据表明高浓度苯唑西林作用MRSA菌株后，细菌上调一些维持细胞壁稳定蛋白（EzrA、EbpS）、上调生长代谢相关蛋白（pgk、rpsG、lipA、ligA、obg）和上调整体蛋白表达水平（Tgt）来抵御抗生素带来的致死作用；其中ezrA、ebpS将有望成为新型药物靶点。