家蚕速激肽受体的功能鉴定及其信号转导分子机制的研究

速激肽作为神经调节物质在中枢神经系统和外周神经系统的神经传递中起到了重要作用，同时对诸如肠道蠕动、平滑肌收缩、心血管功能以及免疫等各种生理过程中起到调节作用，加上昆虫速激肽与脊椎动物速激肽之间的高度保守性，使得家蚕成为研究速激肽及其受体的很好的模式系统。本项目旨在我们前期研究的良好基础上，进一步研究速激肽受体A24和A32的信号转导通路以及详细的调节机制；研究速激肽受体内吞、失敏和胞内转运的机制以及影响速激肽受体信号转导、受体内吞、失敏和胞内转运的结构性决定因素；研究家蚕速激肽受体A24和A32对家蚕生理过程的调节及分子机制。本项目完全是在已有的研究基础上展开的创新研究，为我们进一步理解速激肽及其受体的生理功能，和对生长、代谢、发育等生理过程的调控，及为害虫防治的安全农药的研制，为传统养蚕业的技术革新与经济效益的提高等提供很好的理论基础。

本项目通过系统进化树分析及生物信息学分析，发现家蚕速激肽前体肽中包含六个速激肽成熟肽，因此命名为BmTK1-6。并克隆得到了家蚕速激肽受体A24、A32、A33。我们用家蚕神经肽速激肽刺激异源表达A24、A32和A33受体的HEK293细胞，发现A24、A32 表达细胞有明显的胞内cAMP的积累。并且发现A24介导的cAMP积累是由于受体活化偶联Gαs蛋白的结果。我们还发现BmTKs刺激受体A24能引起较明显的钙流，并随着浓度的升高而增加。BmTKs活化受体A24和A32能够引起ERK1/2磷酸化。同时，我们构建了EGFP融合表达载体，用于检测受体内吞。实验结果发现，A24和A33受体主要定位在细胞膜上，仅有少量分布在胞内。在BmTKs刺激下，A24和A32都能发生内吞。实验结果表明BmTK1能结合到A24上，并引起下游信号转导。我们还发现受体A32序列有可能在家蚕长期驯化过程中部分丢失，其突变型的生理功能改变可能与家蚕在野外环境生存相关。.我们还利用荧光基团Cy5标记的TRP5 (Cy5-TRP5)进行竞争性结合实验。TRPs刺激受体BNGR-A24、A32及A33引起的细胞内钙离子变化。都证实BNGR-A24是家蚕速激肽受体，而BNGR-A32和BNGR-A33更倾向于是Natalisin受体，且TRP能部分活化BNGR-A32。我们发现家蚕神经肽受体BNGR-A24是家蚕速激肽内源性受体。在BNGR-A24表达的昆虫Sf21细胞中，家蚕速激肽TRPs的刺激，能够引起cAMP的积累，胞内钙流，ERK磷酸化以及受体内吞。.我们还证实TKRP1介导的BmTKRPR内吞受网格蛋白Clathrin的调控。并进一步表明BmTKRPR受体内吞后到达早期内含体，最终重新回到细胞膜上。GRK5、PKA和PKC在BmTKRPR受体的内吞中起到了重要的作用。发现BmTKRPR受体胞内环和C末端都有许多GRK/PKA/PKC的磷酸化位点。这表明β-arrestin2在BmTKRPR受体内吞过程中起到了关键性的作用。 因此，我们基本阐明了BmTKRPR内吞的基本途径，即家蚕速激肽样肽受体在配体持续性刺激后，被GRK5、PKA或PKC磷酸化，招募β-arrestin2到细胞膜上，并通过一条clathrin依赖型的途径内吞到早期内含体中，并在内含体中去磷酸化，最终又回到细胞膜上。除此以外，