转基因（GFP）树鼩的基础研究

转基因动物是研究功能基因组学和人类遗传性疾病的核心以及为医药研究和药效评价提供重要的疾病动物模型；树鼩是资源丰富、繁殖周期短的低等灵长类、或最接近灵长类的小型哺乳动物，其在医学研究中已凸显出重要地位；表达绿色荧光蛋白（GFP）的转基因动物是验证能否成功开拓新的转基因动物领域的有力证据，但能否开拓转基因树鼩领域以及转GFP基因树鼩研究中是否存在着障碍仍然是一个悬而未决的问题。在我们前期辅助生殖技术积累的基础上，首先研究树鼩种质细胞的冷冻保存特性和胚胎发育、着床的细胞分子特性，提升生产树鼩"试管婴儿"效率，为转基因树鼩研究铺平道路。同时着重研究能在树鼩胚胎及胎儿组织中表达GFP的转基因载体及其高效的启动子，结合辅助生殖技术，力争获得一种表达GFP的转基因树鼩。本项目的完成既可以推动树鼩物种保护和应用研究，也为人类生命健康研究开拓新的转基因研究领域。

树鼩作为我国新型的、最接近灵长类的、小型哺乳类实验动物，在人类疾病模型研究中具有重要价值。根据项目任务安排，项目完成了三方面工作：在国际上首次创建树鼩辅助生殖技术（ARTs）和构建转GFP基因的树鼩胚胎，以及初步分离培养树鼩胚胎干细胞。在ARTs方面，建立树鼩超数排卵、人工授精和体外受精、胚胎发育和胚胎移植技术，研究了树鼩胚胎的发育生物学特点。这些为树鼩胚胎工程及转基因树鼩研究奠定了基础。在转基因胚胎的构建方面，筛选两种慢病毒载体CAG和CMV为启动子进行试验，结果获得了表达GFP的树鼩新生动物，证明了制作转基因树鼩的可能性。初步分离和培养树鼩胚胎干细胞系，经多潜能基因表达及AP染色验证了其干性。另外，在项目计划外，还克隆了树鼩多潜能基因，利用多潜能基因诱导树鼩成纤维细胞，获得可传30代以上的细胞系，并通过AP染色、核型、多潜能基因表达分析，体外内分化三胚层细胞证明了建立的干细胞系是树鼩诱导多潜能干细胞系。研究了乙二醇和猕猴精浆对猕猴精子冷冻保存的影响。上述研究结果为基因工程树鼩创制，人类相关疾病的分子机理研究创建了重要平台，具有我国独立自主产权和创新性的研究成果。在项目执行期间发表标注基金号文章11篇，其中SCI文章5篇，期间还参编专著2部。培养毕业研究生5名，1篇研究论文荣获云南省优秀硕士学位论文。1人次获得教育部新世纪优秀人才和云南省中青年学术和技术带头人后备人才。在Genbank上获得3个基因mRNA的登录号。