自体牙囊细胞复合β-磷酸三钙生物陶瓷修复牙周组织缺损以及牙齿移动的研究

应用组织工程方法修复牙周组织缺损是口腔医学研究焦点之一，研究表明以牙周膜细胞为组织工程种子细胞可以成功修复牙周组织缺损。牙囊细胞做为牙周膜细胞的前体细胞，具有分化为牙周膜细胞、成骨细胞和成牙骨质细胞的能力，其是否可以做为种子细胞修复牙周组织缺损；其修复能力是否优于牙周膜细胞、牙周组织修复后其牙齿移动情况尚无报道。本研究以体外培养的犬牙囊细胞做为种子细胞通过骨形成蛋白－2、碱性成纤维细胞因子以及地塞米松联合诱导，观察并比较其分化牙周纤维细胞、成骨细胞和成牙骨质细胞的能力；将犬牙囊细胞与β-磷酸三钙生物陶瓷复合，自体移植到牙周组织缺损动物模型中，观察牙囊细胞复合β-磷酸三钙生物陶瓷修复牙周组织缺损以及在牙周组织修复基础上正畸移动牙齿情况，同时与牙周膜细胞的修复进行比较，为临床应用牙囊种子细胞修复牙周组织缺损、治疗牙周疾病、提高自体牙齿移（再）植成功率以及牙周病的正畸治疗提供理论依据

本课题组成功培养并鉴定了牙囊细胞和牙周膜细胞, 利用MTT法证实骨形成蛋白-2（BMP-2）、碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）以及地塞米松三种生长因子联合应用可以有效促进犬牙囊和周膜细胞的增殖能力;同时我们检测了成骨相关指标ALP活性、成骨相关基因COL-I、OPN、BSP的表达以及成骨诱导后矿化结节及脂滴的形成情况，结果显示同时加入三种生长因子后对犬牙囊及牙周膜细胞的成骨能力增强效果最为显著。. 在确定了犬牙周膜细胞具有成骨能力后，我们将其制成细胞膜片，观察膜片的形态、细胞外基质分泌情况以及膜片的成骨成脂能力。我们的数据显示，犬牙周膜细胞制备的细胞膜片层数较多，基质量丰富，能够形成大量的矿化结节和脂滴，具有良好的成骨成脂能力，能够用于牙周组织再生。. 为了获得更好的牙周再生效果，我们建立了牙囊细胞和牙周膜干细胞的直接和间接共培养系统。在间接共培养系统中，检测牙囊细胞对牙周膜干细胞增殖及成骨能力的影响，通过克隆形成实验、细胞周期实验证实牙囊细胞能够促进牙周膜干细胞的增殖能力；通过检测ALP活性、成骨相关基因ALP、Runx2、OCN的表达和成骨诱导后矿化结节和脂滴的形成情况表明牙囊细胞能增强牙周膜干细胞的成骨成脂分化能力，为基于种子细胞的牙周再生提供有利的条件。. 在此结论的支持下，我们构建了牙周膜牙囊复合细胞膜片，并对其进行了HE染色、扫描电镜观察以及成骨能力的检测，结果表明，牙周膜牙囊两种细胞构建的细胞膜片无论细胞层数、基质分泌、成骨基因的表达还是形成矿化结节、脂滴的能力，都较牙周膜或牙囊的单一细胞膜片效果好。因此我们将复合细胞膜片植入裸鼠体内初步观察膜片的牙周再生效果，结果显示复合细胞膜片可以在骨表面形成大量新骨，以及与骨组织连接紧密的纤维组织，再生效果非常良好。接下来我们将牙周膜牙囊复合细胞膜片植入到比格犬牙周缺损模型中，从临床指标和组织学检测两方面来评价复合细胞膜片修复牙周缺损的能力，临床检查发现，复合细胞膜片修复后牙龈退缩和附着丧失情况最轻；对缺损处进行HE染色和microCT检查发现复合细胞膜片修复后骨再生效果良好，证明牙周膜牙囊复合细胞膜片可以有效修复牙周缺损。