与大豆再生相关基因克隆及功能分析

大豆作为重要的粮食和油料作物,其再生体系建立和遗传转化的研究受到了广泛的重视。但大豆的再生体系建立难、遗传转化效率低是世界公认的难题。为了建立高效、稳定的再生体系，我们通过SSH技术和RACE PCR克隆技术，试图分别从子叶节器官发生和体细胞胚胎发生两个途径克隆与大豆再生相关的基因，通过转化烟草、不同再生能力的大豆品种,进行再生基因的功能验证, 分析该类基因在再生体系中的作用，从分子水平上研究大豆再生的发生机理和调控因子。同时，研究不同的植物激素浓度对大豆再生途径相关转录因子基因表达的影响。本研究的宗旨是通过基因的克隆和改造,从分子水平上探究大豆再生的发育机理，试图从根本上提高大豆的再生能力，为建立高效、稳定的再生体系和遗传转化体系奠定基础。

本课题围绕大豆再生相关基因的克隆及功能验证，获得了大豆再生相关基因的抑制性消减文库1个，克隆与大豆再生相关基因2个，并对其功能进行初步验证。文库构建以东农50子叶节为材料，6-BA诱导处理后按小时取材，利用抑制消减杂交技术（SSH），成功构建了大豆再生相关基因cDNA差减杂交文库，从文库中随机挑取918个阳性克隆，将获得的ESTs片段在GenBank数据库进行序列相似性比对，功能分析表明这些基因与信号转导、葡萄糖、蛋白质大分子生物合成代谢，光、叶形态发生相关；调控细胞凋亡、细胞自身防御、细胞壁分化；参与各种激素及细胞分裂素介导的信号通路。从文库中选择HAD超家族中的基因进行克隆，同样以6-BA处理的东农50子叶节为材料构建表达载体，并转化大豆、烟草及拟南芥。以大豆三出复叶为材料，对GmVSP1基因表达的模式进行研究发现，GmVSP1 基因在子叶中表达量最高，其次是茎、根，可推测该基因在子叶再生，茎的伸长中发挥一定的作用。细胞分裂素（6-BA）对GmVSP1基因的表达影响分析表明，GmVSP1基因受6-BA诱导明显，4h时表达量开始升高，8h表达量最高，表达量最多高出野生型5倍。.利用同源克隆技术，通过对植株喷施细胞分裂素，克隆得到细胞分裂素信号途径中的转录因子GmESR1基因，该基因全长1164bp，能编码387个氨基酸。构建植物表达载体后对拟南芥、烟草、大豆进行遗传转化，GmESR1基因在大豆的茎、花和未成熟胚中表达量较高， GmESR1基因受细胞分裂素处理后表达量持续上升，并在1h表达量达到最高，在4h后表达量趋于平稳。GmESR1基因的过表达促进了拟南芥、烟草、大豆幼苗的生长，使烟草和拟南芥的植株矮化，促进了拟南芥分枝的增多、开花期提前。6-BA、ABA及MV处理过表达拟南芥萌发实验表明：6-BA对过表达拟南芥种子起促进作用，ABA和MV对过表达拟南芥起抑制作用。过表达大豆叶盘抗氧化性分析实验发现，过表达大豆植株比野生型植株的抗氧化能力强，叶绿素含量测定进一步确定其抗氧化性。大豆再生相关基因的抑制性消减杂交文库的构建和基因克隆，为深入研究大豆再生分子网络调控和作用机制奠定了坚实的基础。