基于体细胞胚胎发生的毛竹遗传转化体系构建

Bamboo takes an important section in the development of forestry economy. Functional gene was regarded as the primary factor in genetic manipulation of its rapid shoot growth as well as its long flowering interval, and it was expected to utilize bamboo genes through genetic transformation. However, bamboo’s molecular study was hindered by the lack of genetic transformation techniques currently. Phyllostachys edulis will be selected as the material in this project, because its biotechnological study is promising since it’s the only bamboo which had been published genomic sequence. Firstly, key factors affecting somatic embryogenesis and plantlet regeneration as well as their function mechanism in Phyllostachys edulis will be studied, and development synchronization of somatic embryos and their germination percentage will be improved, thus to set an effective somatic embryogenesis as the receptor for genetic transformation. Then workable genetic transformation techniques will be established via agrobacterium-mediation or particle bombardment by screening feasible scheme and detecting of its action mechanism. Such a somatic embryogenesis and genetic transformation system will provide a fundamental protocol for functional gene verification as well as target gene transformation in Phyllostachys edulis, and supply some information for other bamboos, and also progress the study of protoplast regeneration and cell fusion in bamboo.

竹子在我国林业经济建设中占据重要地位。因竹子具有生长迅速、开花难以预测等独特的生长习性，促使人们寄希望于从基因调控的角度，阐述其生长发育机理，从中发掘新的优良基因资源，或通过转基因实现竹子的遗传改良。但现阶段缺乏有效的遗传转化体系，成为制约其在上述领域开展深入研究的瓶颈问题。基于目前毛竹已率先完成基因组测序，迫切需要开展后续分子生物学研究的现状，项目以毛竹为试材，通过对影响其体细胞胚胎发生效率的关键因素与作用机理的研究，攻克以往竹类植物体胚发生同步化差、萌发成苗率低的难题，建立高效的体胚发生系统作为遗传转化受体，并通过比较农杆菌介导和基因枪法在转化效率上的优劣，阐明调控毛竹遗传转化的关键因子及作用机制，建立稳定的遗传转化平台。从而为毛竹功能基因的发掘鉴定、转基因育种等分子生物学领域的研究提供支撑，并为其它竹类植物的同类研究提供示范，也为竹子原生质体再生、细胞融合等细胞学研究奠定基础。

毛竹是我国重要的经济竹种，其基因组测序已于2013年完成，遗传转化体系的缺失成为制约其功能基因研究的瓶颈。.本研究以构建毛竹的遗传转化体系为目标，首先开展了体细胞胚胎发生技术研究，以种胚为外植体，通过培养基优化，实现了稳定的愈伤组织诱导、高效的胚性愈伤组织增殖和较高效率的体细胞胚胎发生，愈伤组织诱导率达24%，其中胚性愈伤组织占比68%，胚性愈伤组织经2周培养可增殖5-7倍，体胚发生的植株再生率达20%。.在此基础上，对基因枪法和农杆菌法转化技术进行了研究，分别建立了转化技术。其中基因枪法转化流程为：质粒用量调整到0.9-1.5μg/枪，设置轰击压力4.5MPa，轰击距离10cm，轰击2次，在原培养皿中培养3 d，再轰击2次，在原培养皿中培养3-5 d后，转移到含25-30 mg/L潮霉素的筛选培养基上，每2周转接一次，培养5-7周可以获得抗性愈伤组织。农杆菌介导法转化流程为：将胚性愈伤组织在含有200 μM乙酰丁香酮的MS液体培养基中预培养2 d，然后在OD600=0.7-0.9的浓度下浸染25 min，经3 d共培养，除菌后置于含有25-30 mg/L潮霉素的培养基上筛选，每2周转接一次，经4-6周培养可获得抗性愈伤组织。.基因枪法转化受基因型的影响不大，8个无性系用基因枪法进行转化后的抗性愈伤组织得率在9.57-18.48%，无性系间的抗性愈伤组织得率差异不显著；但农杆菌介导法受基因型的影响较大，7个无性系的抗性愈伤组织得率均在4.49-11.82%，仅1个无性系的得率高达20.75%，且与其他无性系间的抗性愈伤组织得率差异显著，因此将该无性系作为农杆菌转化的主要材料。将基因枪法和农杆菌法转化后的抗性愈伤组织，置于含有20 mg/L潮霉素的分化培养基上光照培养，2个月植株再生率分别为0.81%，1.23%，对当前获得的23个再生植株中的15株进行检测，发现其中12株中导入了CAS-9片段。.项目首次在毛竹遗传转化中取得突破性进展，相信随着实验技术的进一步成熟完善，将为毛竹基因的功能鉴定、转基因育种等研究提供支撑，并为其它竹类植物的同类研究提供参考。