中度嗜盐菌影响甜菜碱行使渗透保护作用相关基因的克隆、表达及转录调控分析

大多数中度嗜盐菌细胞通过积累甜菜碱等相容性溶质应对外界环境中的盐胁迫。需盐色盐杆菌DSM3043T盐适应范围宽、耐盐度高、全基因组序列已知，是研究中度嗜盐菌耐盐机制良好的实验材料。本室前期实验已利用转座子标签技术获得了该菌在高盐浓度下甜菜碱丧失渗透保护作用的基因突变株CQ1和CQ2。本项目：1）拟利用已得到的基因突变株，克隆和定位影响甜菜碱行使渗透保护作用的基因；2）利用原核表达载体对相关基因进行诱导表达，并对其功能进行鉴定；3）研究不同条件下，相关基因的RT-PCR表达调控模式；4）采用HPLC、NMR等技术，研究不同渗透物、相容性溶质对突变株细胞内积累相容性溶质种类和含量的影响；5）研究不同渗透物、相容性溶质对突变株细胞生长的影响。本课题首次提出：高盐环境下，甜菜碱类的相容性溶质在需盐色盐杆菌DSM3043T细胞内行使渗透保护作用需要相关基因参与，为揭示中度嗜盐菌耐盐机制提供实验依据。

需盐色盐杆菌DSM 3043T菌株属于中度嗜盐菌，能够在含0.5%-25%（w/v）NaCl的培养基中生长，是目前公认地研究中度嗜盐菌耐盐机制的模式菌株。该菌株的基因组全序列已经被测序，但是由于相关遗传操作系统尚未建立，极大影响了对该菌株耐盐机制研究的进一步深入。本项目的研究成果如下：（1）在国内外首次建立了利用转座子标签技术，通过两亲本杂交方法获得了Tn5转座子插入需盐色盐杆菌DSM3043T基因组DNA的方法；（2）在此基础上，利用高盐和低盐浓度的M63矿物盐培养基上筛选接合子，获得了高盐浓度条件下不能生长、低盐浓度正常生长的需盐色盐杆菌DSM 3043T菌株的盐敏感突变株9株。（3）对其中耐盐度较低的三个突变株进行了不同盐浓度生长曲线的测定以及细胞内甘氨酸甜菜碱含量的测定；（4）利用Tail-PCR和反向PCR技术克隆了3个突变株细胞耐盐相关基因，确定了Tn5转座子在基因组DNA中的插入位点。通过生物信息学分析，初步确定这三个耐盐相关基因编码的蛋白分别是o-琥珀酰高丝氨酸硫化氢解酶、肌氨酸氧化酶和功能未知蛋白；（5）构建原核表达载体，分别对o-琥珀酰高丝氨酸硫化氢解酶、肌氨酸氧化酶蛋白进行了重组蛋白的异源表达，其中o-琥珀酰高丝氨酸硫化氢解酶大多以可溶性状态存在，而肌氨酸氧化酶蛋白则以包涵体的形式存在；（6）研究了需盐色盐杆菌DSM 3043T菌株在高盐胁迫条件下全细胞基因的转录情况以及盐激胁迫前后差异转录基因的筛选。结果显示：细胞遭受盐激胁迫后，转录物上调的基因有1587个，转录物下调的基因有672个。对差异转录本做GO富集分析上调的类别个数是1092个，下调的类别个数是482；对差异转录本做KEGG富集分析上调的类别个数是155个，下调的类别个数是98个。差异转录基因中最多的三个COG分别依次为氨基酸转运和代谢类别（64个基因）、能量产生和转换类别（50个基因）以及一般功能类别（49个基因）。差异转录基因KEGG注释上最多的5个代谢途径分别为：ABC转运系统、双组分系统、嘌呤代谢、精氨酸和脯氨酸代谢和核糖体。值得注意的是：利用Tn5转座子标签技术克隆的需盐色盐杆菌DSM 3043T耐盐相关基因与利用转录组学分析结果中差异转录基因的分析结果一致。本项目的研究结果可以为进一步深入需盐色盐杆菌DSM 3043T菌株独特的耐盐机制提供了良好的理论和实验基础。