染色质重塑基因ARID2在肝癌中的临床意义及相关功能研究

Our recent work described novel inactivating somatic mutations of ARID2 (AT-rich interactive domain 2) in HCC through exomic sequencing, which is a chromatin remodeling gene.The type of mutations suggested it was a tumor suppressor gene according to genetic principles. The mutations showed trends of advantage in HCV-related HCC than in HBV-related HCC. Functional studies have showed that ARID2 was essential for the stability of the PBAF complex and could impact the IFN signaling, through which it played a role as a tumor suppressor gene，as we hypothesized. So in this study, more HCV-related HCC and HBV-related HCC should be enrolled. Sequencing and IHC analysis of ARID2 in these patiens will be done to verify whether ARID2 is specific for HCV-related HCC and its clinical significance will be discussed. Furthermore, ARID2 of different expression level will be established in HCC cell lines, through plasmid or shRNA transfusion. Cell growth rate, cell cycle will be analyzed in these cell lines to demostrate that ARID2 is a TSG. Expression of subunits of PBAF complex and components of IFN signaling will also be examined to show the possible mechanism how ARID2 plays its role.

申请人前期通过外显子测序，发现一个肝癌中出现较高频率体细胞突变的染色质重塑基因ARID2。突变类型提示其可能为抑癌基因，且表现出HCV相关肝癌特异性倾向（结果发表在Nature Genetics上）。通过结构和功能分析并结合文献，推测ARID2发挥抑癌作用的途径包括影响PBAF复合物的稳定性和干扰素信号通路，但尚需进一步证实。本研究拟对更多肝癌标本的ARID2进行测序，并行免疫组化染色，以明确ARID2突变频率在HBV和HCV相关肝癌间是否存在差异，并结合临床随访资料判断其是否可作为预后标志。此外拟在肝癌细胞系中高表达ARID2、抑制ARID2表达及ARID2定位突变，并检测细胞生长和细胞周期的变化，证明其为抑癌基因并分析其关键结构域。同时采用RT-PCR和western blot法检测ARID2对PBAF其他亚基和干扰素通路中多个重要分子表达水平的影响，探讨其发挥抑癌作用的可能机制。

前期我们通过外显子测序的方法对10例HCV相关肝癌患者及后续入组病例进行分析，发现了一个新的基因ARID2的失活突变，这提示我们ARID2是一个抑癌基因。ARID2基因发生突变能够促进HCV相关肝癌的发生，但是具体的机制仍需探讨。作为BAF/PBAF复合物中重要的亚单位，我们关注ARID2的突变对整体复合物稳定性的影响，ARID2的突变可能降低了复合物的稳定性。同时，由于突变在HCV相关肝癌中的富集现象，我们探索ARID2同干扰素信号通路之间的关系。通过对两株肝癌细胞系PLC和SMMC7721的RNA-Seq，瞬时敲减ARID2的表达后，将两株细胞差异表达的基因进行了比对并发现了七个共同变化且具有相同变化趋势的基因。在七个基因中，CDKN1A（又名p21）在敲减ARID2后表达量降低，并且通过Q-PCR及WB得到验证。P21是细胞凋亡的关键调节因子，因此我们采用硼替佐米诱导细胞凋亡来观察ARID2的肿瘤抑制功能。比较能够正常表达ARID2蛋白的对照组及瞬时敲减ARID2表达的实验组，PLC及SMMC7721细胞在敲减ARID2的表达后均表现出了抗凋亡的效应。在使用索拉菲尼及奥沙利铂诱导细胞凋亡时我们也获得了同样的实验结果。这些结果说明了ARID2的突变赋予HCC肿瘤细胞一定的抗药性。综上，我们的实验结果提供了ARID2作为抑癌基因发挥功能的一个可能的机制，这或许可以作为临床采用索拉菲尼及奥沙利铂进行肝癌病人治疗的参考，提前预判治疗疗效。