醋栗番茄液泡膜NHX4基因启动子响应盐胁迫的顺式作用元件及互作转录因子的鉴定

Soil salinity is one of major abiotic factors that affect crop production and ecological environment worldwide. Therefore, a thorough understanding of salinity tolerance mechanisms in plants is critical for improving plant salt tolerance and ecological environment. However, research on mechanism of salt tolerance genes expression regulation, which is an important part of salinity tolerance mechanisms in plants, processes slowly. Our research results showed that the transcription level of vacuolar Na+/H+ antiporter 4 (NHX4) gene of wild Solanum pimpinellifolium was induced strongly by salt stress. The aim of this project is to study the mechanism of transcriptional regulation of NHX4 gene of Solanum pimpinellifolium under salt stress. In this project construction and function of the promoter of Solanum pimpinellifolium NHX4 gene will be analyzed by comparative genomics, bioinformatics and molecular biological methods. The cis-acting element in response to salt stress in the promoter region will be identified by deletion mutation and point mutation methods. The interacting transcription factor will be identified by yeast one-hybrid system, electrophoretic mobility shift assay and chromatin immunoprecipitation assay. And the mechanisms of transcriptional regulation of Solanum pimpinellifolium NHX4 gene in response to salt stress will be analyzed. These results would be helpful for understanding salinity tolerance mechanisms and signal transduction in plants.

研究植物的耐盐性对于培育耐盐植物品种及改善生态环境具有重要意义。植物耐盐基因的表达调控研究是植物耐盐性研究中的重要内容，但目前进展缓慢。本项目组的前期研究发现，耐盐的野生醋栗番茄液泡膜Na+/H+逆向转运蛋白4 (NHX4)基因的转录活性受到盐分胁迫的强烈诱导，转录活性很强。为了进一步研究醋栗番茄NHX4基因响应盐分胁迫的转录调控机制，本项目拟采用比较基因组学和生物信息学的方法分析预测醋栗番茄NHX4基因启动子中与盐胁迫相关的调控区域；在此基础上通过一系列缺失突变、取代突变及点突变等分子生物学技术，鉴定出该启动子区域中响应盐分胁迫的顺式作用元件；再通过酵母单杂交技术、电泳迁移率实验、染色质免疫共沉淀技术等筛选、鉴定出与盐分响应元件互作的转录因子；并在此基础上解析醋栗番茄NHX4基因响应盐分胁迫的转录调控机制，为研究植物的耐盐机制和耐盐信号转导途径提供新的资料。

植物液泡膜Na+/H+逆向转运蛋白(vacuolar membrane Na+/H+ antiporter,NHX) 能够将地上部细胞中过多的Na+隔离至液泡从而降低了胞质中过多Na+带来的毒害，故在植物的耐盐机制中发挥着重要作用。我们前期研究发现醋栗番茄(Solanum pimpinellifolium L.)SpNHX4基因的表达受到盐分胁迫的诱导。为了进一步研究醋栗番茄SpNHX4基因响应盐分胁迫的转录调控机制，我们在本项目的资助下，通过染色体步行法克隆出了SpNHX4上游1976bp的启动子序列，并对其进行生物信息学分析。通过构建一系列的5'端缺失片段与报告基因的表达载体，遗传转化番茄外植体，检验缺失片段的启动子活性和盐分诱导活性，发现SpNHX4基因上游-1931~-1645bp的区域具有较强的应答盐胁迫的诱导启动子活性。该区域存在四个预测的顺式作用元件，我们推测其中的干旱诱导的MYB结合位点“CAGTTA”可能是该启动子应答盐胁迫的顺式元件。为了筛选出与该调控区域结合的调控蛋白，以这段核心序列为诱饵, 通过酵母单杂交系统筛选得到了与之结合的调控蛋白，经blastn比对发现，该蛋白确实是我们预测的转录因子MYB，并通过电泳迁移率实验证明了二者在体外能够结合。取代突变实验证实了-1931~-1645bp区域内的“CAGTTA”序列确为SpNHX4应答盐胁迫的顺式作用元件。构建SpMYB基因的植物过表达载体，遗传转化醋栗番茄，发现转基因植株叶和根中SpNHX4 基因的表达水平均高于野生型植株，证实了醋栗番茄细胞中SpMYB基因确实能够加强SpNHX4 的转录。表达分析实验结果显示SpMYB的表达受到干旱、盐胁迫和ABA的诱导。这些结果对于深入研究植物的耐盐机制和耐盐信号转导途径提供新的资料，同时也为研究植物耐盐基因的表达调控机理提供了新的内容。