骨细胞Cx43组成的间隙连接和半通道在骨折愈合进程中的作用机制

In bone tissue, gap junctions and hemichannels formed by connexin43 (Cx43) play important roles in regulating signal transmission among different bone cells or cells and extracellular matrix, thereby regulate bone remodeling. Fracture healing is a complex regenerative process that involves the communication between bone cells. Osteoblast selective Cx43 deficient mice show impairments in healing by altering the expression of β-catenin. Two osteocyte selective Cx43 dominat negative transgenic mice have been imported (R76W and △130-136),both of gap junctions and hemichannels were blocked in △130-136, while only gap junction was blocked in R76W. Our previous studies have shown the alteration of bone structure, bone histomophology and bone remodeling in transgenic mice.Also the difference has been shown between the two transgenic mice. In the study, femoral fracture will be generated in transgenic and wild type mice. And the progress of healing progress will be investigated. The function of bone cells will be detected at the site of fracture and using isolated bone cells from transgenic mice. Wnt/β-catenin signal pathway and some important modulators will be investigated in primary osteocytes isolated from transgenic and wild type mice. This study will give some clues for the interaction mechanism between bone cells and clinical therapy of fracture.

骨折愈合是多种细胞协同作用的骨再生重建过程。连接蛋白connexin43（Cx43）组成的间隙连接和半通道是骨组织细胞间主要的信号传递方式，调节骨代谢。成骨细胞敲除Cx43的小鼠骨折愈合受到了抑制，且与Wnt通路相关。申请者引进了骨细胞显性负突变Cx43的转基因小鼠R76W和△130-136，△130-136的间隙连接和半通道都被抑制，R76W只抑制间隙连接。发现骨结构和骨重建都有改变，但两者间有明显区别。 本项目拟：①建立转基因小鼠股骨骨折模型，研究骨细胞间隙连接和半通道功能抑制对骨折愈合不同阶段骨结构功能和骨组织细胞功能的影响；②检测转基因小鼠原代骨细胞损伤对成/破骨和间充质干细胞功能的影响；③研究Wnt/β-catenin通路介导Cx43调节骨折愈合的分子机制。为深入揭示骨折愈合中骨组织细胞间相互作用机制提供科学依据，有助于丰富骨生物学理论，并为临床骨折病人有效治疗提供新靶点。

骨折愈合是多种细胞协同作用的骨再生重建过程。连接蛋白connexin（Cx）43组成的间隙连接和半通道是骨组织细胞间主要的信号传递方式，调节骨代谢。有研究结果显示成骨细胞敲除Cx43的小鼠骨折愈合受到了抑制，且与Wnt通路相关。本研究使用了两种骨细胞显性负突变Cx43的转基因小鼠R76W和∆130-136作为研究对象，∆130-136的间隙连接和半通道都被抑制，R76W只抑制了间隙连接，而半通道功能被促进。我们建立了转基因小鼠的胫骨骨折模型，分别在骨折后的第7天（炎症期），14天（软骨痂形成期），21天（硬骨痂形成期）和28天（重建期），处死小鼠，收集小鼠胫骨，分析了骨结构功能和骨标志代谢因子的表达，探讨了骨细胞上这两种通道功能改变对整个愈合进程的影响。在体外实验部分，培养了MLO-Y4细胞，研究了阻断半通道和抑制Cx43表达对相关基因mRNA水平表达的影响。.研究结果显示，骨折后28天，R76W小鼠骨痂处的新骨形成比∆130-136和WT小鼠有明显增加。同时对关键调控因子表达免疫组化原位检测显示，在骨折后第7天，炎症相关因子TNF-α的表达在R76W小鼠中明显上调；同时，ColII的表达也表现出上调的趋势；在第21天，骨钙素OCN的表达也是在R76W小鼠中明显上调，这些结果显示R76W小鼠半通道的促进可能促进了骨折愈合进程。而骨折后28天，∆130-136小鼠的破骨细胞形成明显增加，WT和R76W小鼠的破骨形成在21天时已经达到最高水平。对破骨标志调控因子RANKL/OPG的检测也发现了同样的规律，而骨折后14天时成骨抑制基因Sost的表达在∆130-136小鼠中有明显增加。我们认为对间隙连接的抑制可能延缓了破骨细胞形成及骨折愈合过程。.在体外实验部分也证实，Cx43的抑制剂18β-GA和半通道特异抗体E2处理都增加了TGF-β、β-catenin、OSX、SOST、OPG、Runx2和TRAP的表达，降低了OC和ColI的表达。表明间隙连接和半通道功能的抑制能对Wnt/β-catenin信号通路产生影响，且能改变骨代谢相关调控因子的表达。