蛋白酶体新结合蛋白USP7在多发性骨髓瘤硼替佐米耐药中的作用机制研究

Bortezomib (BTZ)-resistance is an urgent problem to be solved in clinical treatment of multiple myeloma (MM). Although lots of studies have proved that proteasome play a key role in BTZ-resistance,the mechanism of it is still unclear. Therefore, further studing on the mechanism of BTZ-resistance is necessary for overcoming BTZ-resistance. In our previous studies, we identified that ubiquitin-specific protease 7 (USP7) was a new proteasome-interacting protein (PIP), which was upregulated in many MM cells.Futhermore,we found that USP7 knockdown could obviously increase the MM cells sensitivity to BTZ. However, the mechanism of USP7 involved in BTZ-resistance is not elucidated.In this project, we will establish cell strains with USP7 knockdown by stably expressed interfering shRNA through constructs of pLK-shUSP7-GFP using modified lentiviral vectors based transfection system in BTZ-resistance MM cells ，and then rescue the expression level of USP7 in the BTZ-resistance MM (shUSP7) to elucidate the role of USP7 in BTZ-resistance through regulating proteasome in vitro and in vivo. As scheduled, our study will illuminate the function of USP7 in BTZ-resistance，and will provide new targets for MM treatment.

硼替佐米耐药是临床治疗多发性骨髓瘤亟待解决的问题之一。虽然有大量实验证实耐药形成与蛋白酶体功能相关，但其耐药机制尚不清楚。因此,深入研究蛋白酶体在硼替佐米耐药中的分子机制将为寻找逆转硼替佐米耐药的新靶点提供理论依据。我们的前期研究发现，去泛素酶7(USP7)是一种新型的蛋白酶体结合蛋白，并且在多种多发性骨髓瘤细胞系中高表达;进一步通过免疫沉淀证实USP7可与蛋白酶体相互作用，并发现下调USP7可增强硼替佐米对骨髓瘤耐药细胞的杀伤作用，但USP7参与硼替佐米耐药的机制尚未阐明。本课题中，我们计划先通过RNA干扰技术建立稳定下调USP7的骨髓瘤耐药细胞株，再恢复干扰耐药细胞株中USP7的水平，从体内和体外两个层面，探究USP7通过参与蛋白酶体的调控影响硼替佐米耐药的机制。如期完成，我们的研究将阐明USP7在硼替佐米耐药形成中的作用，为临床克服多发性骨髓瘤耐药提供新靶点。

多发性骨髓瘤至今仍是一种不可治愈的恶性血液肿瘤。2003年FDA批准硼替佐米临床用药后，虽改善了骨髓瘤患者的症状，提高了生存期，但硼替佐米耐药发生率逐年提高，成为临床亟待解决的问题之一。研究硼替佐米耐药的分子机制和寻找克服耐药的新型小分子药物成为目前研究的重点。在本项目的资助下，我们证实了去泛素酶7(USP7)在调控多发性骨髓瘤硼替佐米耐药中起到关键作用，并发现荜茇酰胺(piperlongumine)可部分克服胞硼替佐米耐药。具体内容概述如下：(1)USP7在6种骨髓瘤细胞中均高表达，在硼替佐米敏感和耐药细胞株中表达存在差异；(2)利用CRISPR/Cas9技术在耐药细胞株中敲除USP7，通过单克隆筛选出阳性克隆细胞；(3)USP7下调后，耐药细胞对硼替佐米敏感性增加，增殖和抗凋亡能力减弱，下调ERK的活性；(4)荜茇酰胺可抑制耐药株细胞增殖促进凋亡，低浓度(1.5μM)时可增加其对硼替佐米的敏感性；(5)体内实验，裸鼠皮下移植瘤及NSG小鼠骨髓瘤弥散型模型均显示荜茇酰胺可有效的抑制多发性骨髓瘤的增殖；(6)荜茇酰胺不依赖于蛋白酶体的β5亚基，而是通过竞争性结合与STAT3的Cys712位点，抑制STAT3通路的活性来发挥抗多发性骨髓瘤的作用。综上，通过本研究基本阐明去泛素酶USP7是多发性骨髓瘤硼替佐米耐药的关键调控因素之一，为临床治疗耐药复发患者提供新的潜在靶点。另一方面本研究发现，荜茇酰胺不仅可以显著的抑制多发性骨髓瘤敏感细胞株的活性，还可以部分逆转硼替佐米耐药，增加耐药细胞株对硼替佐米的敏感性，通过竞争性结合与STAT3的Cys712位点抑制其活化来实现。进一步证实多发性骨髓瘤硼替佐米耐药形成是多通路相互作用的结果，STAT3通路可作为逆转硼替佐米耐药的另一潜在靶点，同时暗示荜茇酰胺可作为先导化合物进一步研究开发以应用于多发性骨髓瘤的临床治疗。