应用荧光分子成像技术研究肿瘤治疗过程中Calpain调节GSK-3β活性的分子机制

诱导细胞凋亡是肿瘤治疗的重要策略之一, 探讨肿瘤细胞凋亡的分子机制,将为制定行之有效的抗肿瘤方案提供可靠的理论基础。本项目将深入研究肿瘤细胞凋亡的分子机制，重点探讨Calpain调节GSK-3β活性的分子机制。以经典化疗药物Cisplatin诱导细胞凋亡为研究模型，应用FRET等先进的荧光成像技术分别在活细胞水平和活体水平实时检测Calpain对GSK-3β活性调节的动态变化过程。同时结合免疫印迹、免疫共沉淀、RNA干扰等技术手段，深入研究活化后的GSK-3β对肿瘤细胞凋亡中典型分子事件的影响（如Caspase家族蛋白激酶的活化，BCL-2家族蛋白的活化，细胞色素c 释放等），评价其在肿瘤治疗过程中的作用。期望通过本项目的研究，从分子水平深入了解Calpain、GSK-3β所介导的肿瘤细胞凋亡的机理，为制定以Calpain、GSK-3β为靶点的肿瘤临床理疗方案提供可靠的理论基础。

本项目旨在深入研究肿瘤细胞凋亡的分子机制，重点探讨Calpain调节GSK-3β活性的分子机制。以经典化疗药物Cisplatin诱导细胞凋亡为研究模型，应用FRET等先进的荧光成像技术分别在活细胞和活体水平实时检测Calpain对GSK-3β活性调节的动态变化过程。成功的关键在于构建高灵敏度, 高效率的FRET探针。我们在前期阶段遇到一定的困难。 我们通过在GSK-3β的N端和C端分别融合YFP和CFP后， 发现该突变体不能在细胞内成功表达。基于此失败结果，我们不断调整、改进实验方案，采用GFP和DsRed的 FRET 配对构建新的探针；同时，在融合点引入合适的linker。最终，我们成功筛选到高效率、高灵敏度的探针。 在成功获得探针后，研究进展顺利，我们能在化疗药物Cisplatin诱导的细胞凋亡过程中， 实时、灵敏地探测到GSK-3β被切割调控的动态变化，通过免疫印记的方法， 能证实所得实验结果。 通过添加Calpain的抑制剂能阻断GSK-3β的切割， 表明GSK-3β的切割受Calpain的调控。其在肿瘤发生发展中的作用及在肿瘤预防治疗中的地位将在随后的研究中继续探索。同时，该项目资金还用于以下项目研究：1. 探讨Aβ诱导神经细胞凋亡的分子机理。结果表明，Aβ能诱导PUMA的活化， 从而促进神经细胞凋亡； 2. 探讨低功率激光辐照（Low-Power Laser Irradiation，LPLI）调控神经细胞生理活性的分子机制。结果表明，LPLI 能通过激活Akt/GSK3β/β-catenin 信号通路来抑制Aβ25-35诱导的细胞凋亡，从而促进神经细胞存活。进一步研究结果表明，激光辐照能够上调 BDNF (brain-derived neurotrophic factor )的表达，从而延缓AD的进程；3. 探讨LPLI调控细胞衰老的分子机制。我们首次发现LPLI能通过激活PI3K/Akt而活化SRIT1 蛋白，进而延缓细胞衰老；4. 探讨基于溶酶体靶向性光动力学治疗诱导细胞凋亡的分子机理。研究结果表明， 溶酶体光损伤能激活ASK1/JNK信号通路，该信号通路是活化Bax的关键因素；5. 探讨激光辐照治疗肿瘤的免疫应答机制。 结果表明，高剂量激光辐照诱导的超氧爆发与抗肿瘤的免疫应答有紧密联系。以上研究所取得的进展和成果将在结题报告正文中详细论述。