朴树抗炎活性物质的发现、结构改造与作用机制研究

Considering about the problem that ginkgo phenol/acid usually leads to allergies (inflammation) and is difficult to be removed from ginkgo products, and base on the folk experience that “Hackberry can effectively prevent urushiol caused allergy”, hackberry was used as research object for that ginkgo phenol/acid shows similar structure and toxic/side effect as urushiol, compounds with anti-inflammatory activity in hackberry and its structure-activity relationship will be studied. According to the in vitro inhibitory activity on T cell mediated inflammation, the effective components will be separate and purified from the leaf and bark of hackberry, pure ingredient with best detoxification effect against ginkgo phenol/acid will be chose for preparation and structure analysis. Investigate the effect of anti-inflammatory ingredient from hackberry on the activation of enzyme protein such as SHP2 phosphatase and its downstream signaling pathway. Study the binding effect between hackberry ingredient and SHP2 or other key molecule, and reveal the anti-inflammation target of hackberry ingredient. Base on the structure of anti-inflammatory ingredient and target protein, a series of derivatives can be designed by computer modeling for better targeting effect, the structure-activity relationship between hackberry ingredients will be clarified through the comparing of anti-inflammatory activity. The results of the study are expected to obtain a new kind of anti-inflammatory compound, supply theoretical basis for preparing ginkgo tea with other products, supply theoretical basis for the solution of the of the pro-inflammatory problem brought by ginkgo phenol/acid and the design of anti-inflammaory compound against ginkgo phenol/acid.

针对银杏产品中银杏酚酸易导致过敏（炎症反应）及其脱除困难的难题，以民间经验“能有效防治漆酚过敏”的朴树为研究对象，基于银杏酚酸与漆酚结构及毒副作用相似的特点，对朴树中具有抗炎活性的物质及其构效关系开展研究。根据体外抑制T细胞介导炎症反应的活性，对朴树叶和皮中的有效成分进行分离、纯化，选取对银杏酚酸解毒作用最强的成分进行纯品制备和结构解析；考察朴树成分发挥抗炎作用时对磷酸酶SHP2等酶蛋白活化、下游信号转导的影响，揭示朴树成分与炎症细胞中SHP2等关键分子的结合作用，探明朴树抗炎成分的作用靶点；基于该抗炎成分的分子结构以及靶蛋白的结构，通过计算机模拟，设计出与靶蛋白的特定部位具有更强靶向结合作用的衍生物，并对其抗炎活性进行比较，阐明朴树成分抗炎作用的构效关系。研究成果有望获得一种新型抗炎活性物质，为银杏茶等产品的配伍，为银杏酚酸炎症问题的解决及抗银杏酚酸炎症化合物的设计提供理论依据。

通过比较不同地区的朴树叶提取物的抗炎活性，选择了贵州地区一个野生品种的朴树作为研究对象。基于抗炎活性筛选，从朴树叶中分离得到了14种单体化合物，通过对朴树叶提取物的液质联用检测、以及单体的核磁共振分析共鉴定出16个化合物结构，分别为芹菜素-7-O-葡萄糖基葡萄糖苷、牡荆素-2''-鼠李糖苷、山奈苷、刺槐素-7-O-葡萄糖苷、β-谷甾醇、熊果酸、白桦脂醇、2,4-二羟基苯甲醛、2,4-二羟基苯甲酸、槲皮素、芹菜素、异牡荆素、牡荆素、芦丁、荭草素和异荭草素。其中异牡荆素是朴树叶中的主要黄酮类化合物，并且具有较好的抗炎活性，结构上区别于常见的氧苷黄酮，因此被用于银杏酸（GA）的减毒活性研究。结果表明异牡荆素一方面能够减轻GA导致的小鼠急性肝损伤，降低血清中的转氨酶水平；另一方面可以抑制GA导致的小鼠接触性皮炎，抑制炎症因子IL-2、INF-γ、IL-6和IL-17a的mRNA表达以及血清中TNF-α的分泌，促进GA诱导的活化T细胞的凋亡。基于T细胞的Western bloting实验结果表明，异牡荆素能够能够上调JNK的磷酸化，抑制AKT的磷酸化，进而促进Con A活化的T细胞凋亡。通过分子对接发现异牡荆素和酪氨酸磷酸酶SHP2有相互作用，提示其抗炎作用机制可能与SHP2的功能有关。研究阐明了朴树中抗炎活性物质的种类及结构组成，找到了能够通过抑制T细胞介导的炎症减除GA毒性的成分；建立了一种银杏酚酸的配伍减毒方法，为银杏茶和白果等产品的减毒增效提供了可能。. 当然，银杏酚酸的致敏问题和毒副作用因人而异，在研究中也发现不同品系小鼠个体差异较大，银杏酚酸不应成为阻碍银杏叶和银杏果等产品开发的绊脚石。但是，这种个体差异和不稳定性给项目研究带来了很多麻烦，在今后的研究中可以选择更加成熟的银杏酚酸致敏模型，比如以明确的靶细胞和靶蛋白为研究对象。从朴树叶甲醇提取物和异牡荆素对GA的减毒效果差异来看，朴树叶中应该还存在其他活性更好的成分，没能在本项目研究中一一解析，今后值得继续针对朴树叶中的抗炎成分进行研究，开发对GA减毒作用更好的产品。