溶藻弧菌诱导赤点石斑鱼头肾和外周血免疫应答的差异性研究

石斑鱼是一种重要的水产养殖鱼类，人们对于它的研究主要集中在生物学、养殖、营养方面，石斑鱼在养殖过程中常常由于病害特别是细菌病害导致减产，而石斑鱼免疫研究在国内外才刚起步。本项目尝试从溶藻弧菌诱导石斑鱼免疫应答切入，利用抑制性消减杂交技术，首次构建溶藻弧菌感染后不同时间段的石斑鱼头肾和外周血免疫响应基因的消减cDNA文库，检测免疫中枢和免疫应答核心在免疫应答早中晚期参与抵御弧菌侵染的基因变化的差异性，并有针对性地克隆与免疫应答相关的基因，分析其蛋白表达，组织定位，生化活性和细胞学作用，明确它们调控机体免疫应答的作用，以期能对养殖鱼类应对弧菌侵染而发生的呈递式、联合式的免疫调控机制进行深层次的了解，为寻找与免疫相关的抗病基因提供线索，为病害防治研究提供理论依据。本研究从生产实际中选题，对于鱼类的健康养殖具有重要的意义，为利用鱼类自身的免疫防御基因加强抵抗病害感染的能力打下了基础。

石斑鱼作为一种重要水生养殖动物在免疫功能基因研究上还比较薄弱，人们对于石斑鱼的研究主要集中在营养、养殖、病害防治方面，在分子免疫防御领域的研究还比较少。本项目利用抑制缩减杂交技术研究赤点石斑鱼头肾和外周血免疫调控机制。希望通过建立和筛选这两个免疫组织在病原菌感染后不同时间的抑制缩减文库，分别建立免疫防御调控相关基因的表达谱并分析其差异性。从正向和反向文库中各筛选得到31和16个免疫期间表达丰度上调或下调的基因，进一步功能注解发现，正向文库功能基因包括免疫信号传导相关蛋白、防御相关蛋白、肿瘤免疫相关蛋白和淋巴细胞相关蛋白，这些基因免疫后表达丰度升高，提高了机体免疫抵抗力。负向文库功能基因包括细胞免疫相关蛋白、感染相关蛋白和肿瘤发生相关蛋白，这些基因免疫后表达丰度降低，可以降低机体感染和发病几率。感染过程中，头肾和血细胞中基因表达谱差异较大。筛选赤点石斑鱼机体免疫防御调控的相关基因，克隆和分析7个与免疫应答相关的目标功能基因的全长cDNA，如白细胞介素、肿瘤坏死因子、溶菌酶、IkB-α和干扰素等，并采用实时定量技术分析筛选出的免疫调控相关基因的表达模式, 以及LPS和溶藻弧菌刺激后的应答规律；利用生物信息学对预测其功能和结构,进行同源性分析及构建进化树，而且重组表达了肿瘤坏死因子、溶菌酶、IkB-α融合蛋白，制备了抗融合蛋白多克隆抗体；利用荧光融合蛋白技术研究IkB-α和p65在EAS1细胞中的共定位；通过荧光素酶报告基因试验检测了 IkB-α在 EAS1细胞中的信号激活能力；最后采用抗体抑制相关基因蛋白和体外注射重组蛋白的途径，在石斑鱼体内，分别抑制和增强特定蛋白活性，检测处理前后相关基因对石斑鱼各种免疫应答指标的影响，对它们在先天免疫反应中的功能进行了较为深入的研究，在静息的细胞中，NF-κB 和IκB形成复合体，以无活性形式存在于胞浆中。当细胞受溶藻弧菌感染信号刺激后， IκB发生磷酸化诱导降解，游离的NF-κB迅速移位到细胞核，诱导参与免疫反应的早期和炎症反应各阶段的许多分子如TNF-α、IL-1β、溶菌酶和干扰素等表达和参与免疫相应。本项目的实验结果为揭示鱼类免疫的模式识别、免疫信号传导途径、免疫调控规律和抗感染模式奠定基础，为养殖鱼类功能基因的开发提供技术手段和分子生物学基础。