运用三维培养探讨淫羊藿苷经P38/ERK-MAPK通路促进BMSCs成软骨分化的作用及机制

Articular cartilage injury is a common disease and presents a major clinical challenge in the orthopedics.Bone marrow mesenchymal stem cells (BMSCs) have the ability to differentiate into chondrocyte.Our previous study found that some growth factors could induce the chondrogenesis of BMSCs and improve the restoration efficiency of cartilage defect in rabbit model.However,growth factors can't accurately control cartilage differentiation.Therefore,it is necessary for us to find the substitute for growth factors with low cost,steady activity and security.Icariin is widely used pharmacological constituent in orthopedics and some studies revealed that icariin could promote BMSCs osteogenic differentiation and enhance chondrocytes chondrogenesis.To solve the bottleneck of icariin pomoting BMSCs chondrogenesis differentiation,we firstly utilize co-culture system to induce BMSCs chondrogenesis,and discuss whether icariin could enhance BMSCs chondrogenesis,keep the hyaline cartilage phenotype and reveal the molecular mechanisms through the cartilage dyeing,cartilage gene expression and detection of the phosphorylation and the expression level of mitogen activated protein kinase (MAPK) pathways,especially via activating P38/MAPK pathway and inhibting ERK/MAPK pathway.This study will provide theoretical support of icariin substituting for growth factors in the trearment of articular cartilage injury.

关节软骨损伤是临床常见、多发病，现已成为骨科领域治疗的难点之一。骨髓间充质干细胞（BMSCs）具有向软骨细胞分化的潜能，我们的前期研究发现BMSCs经某些生长因子诱导可向软骨细胞分化并可修复动物的软骨缺损。但生长因子不能精确调控软骨分化，故寻找一种安全、高效且可替代生长因子的靶点药物成为当务之急。淫羊藿苷（icariin, ICA）是骨伤科常用且安全的中药单体，研究发现ICA既具有促进BMSCs成骨分化又具有促进软骨细胞成软骨作用。为解决ICA促进BMSCs成软骨分化的瓶颈问题，我们首次利用软骨细胞与BMSCs在三维共培养系统下诱导BMSCs成软骨分化，通过软骨染色和基因表达、MAPK通路中P38、ERK磷酸化水平的检测，探讨ICA可促进BMSCs向软骨细胞分化并保持透明软骨表型的分子机制- - 激活P38/MAPK及抑制ERK/MAPK信号通路，为ICA替代生长因子治疗软骨损伤提供理论支持。

骨性关节炎是临床常见病，因软骨组织修复能力差而成为临床治疗的难点。骨髓间充质干细胞具有向骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞等多向分化潜能，因此再生软骨修复被认为是治疗软骨损伤最有潜力的临床方法。然而，软骨分化过程中所添加的生长因子存在费用昂贵、易降解、具有免疫原性并且可促进软骨细胞的肥大分化、难以保持透明软骨表型等诸多缺点，故迫切需要寻找一种安全、高效促进成软骨分化的靶点药物。淫羊藿苷是骨伤科常用且安全的中药单体，被临床广泛用于治疗骨质疏松。基于最新研究显示淫羊藿苷可促进软骨细胞生长及细胞外基质分泌，本课题组在体外单层培养诱导大鼠骨髓间充质干细胞成软骨分化，同时添加1×10-6 mol/L淫羊藿苷，采用qRT-PCR、蛋白免疫印迹法及免疫荧光染色检测成软骨特异指标Ⅱ型胶原、蛋白多糖和成软骨转录因子Sox9的基因表达及蛋白合成情况，并测定软骨细胞肥大分化的特异指标Ⅰ型胶原的基因表达和碱性磷酸酶的活性，首次报道了淫羊藿苷可以明显促进骨髓间充质干细胞形成更多且直径更大的聚合体，并提高Ⅱ型胶原、蛋白多糖和Sox9的基因表达及蛋白合成，但是没有明显促进骨髓间充质干细胞向肥大的软骨细胞分化。此外，我们也采用功能性自组装多肽纳米纤维水凝胶支架与骨髓间充质干细胞细胞复合进行3D细胞诱导分化，结果显示淫羊藿苷可以明显促进骨髓间充质干细胞向软骨细胞分化。因此，本课题组认为淫羊藿苷可促进骨髓间充质干细胞直接成软骨分化，并维持软骨细胞表型，有望成为软骨组织工程中一种安全有效的促进剂。