癌基因CDH4激活JNK/c-Jun信号通路调控骨肉瘤干细胞表型的实验研究

Osteosarcoma (OS) is the most common primary bone malignancy in children and adolescence，with poor prognosis and unknown mechanism of sarcogenesis.This clinical dilemma necessitates further exploration of mechanisms regarding sarcogenesis in osteosarcoma.We and other investigators revealed that osteosarcoma stem cells initiate tumor formation and progression. Our previous study found that CDH4 is amplified in osteosarcoma, leading to abnormally high expression of R-cadherin. Meanwhile, we evidenced R-cadherin can activate c-Jun via JNK pathway and consequently regulate features of osteosarcoma stem cells. This project aims to further study: (1) the role of CDH4/JNK pathway in regulation of osteosarcoma stem cells with various experiments including single cell detection technique, lentiviral expression systems and in vivo imaging methods; (2) prognostic value of CDH4/JNK pathway in osteosarcoma using tissue microarrays; (3)prediction value of serum CDH4 in osteosarcoma patients assessed by real-time PCR arrays. Our project will help expand our knowledge of sarcogenesis and progression of osteosarcoma.

骨肉瘤是儿童和青少年最常见的原发恶性骨肿瘤，预后差且发病机制不清，我们和其他研究者发现骨肉瘤干细胞起始骨肉瘤的形成和进展，因而深入研究其成瘤机制并鉴定新的治疗靶点为改善预后的突破口。我们前期研究发现骨肉瘤肿瘤组织和细胞株中CDH4异常高表达，为癌基因，且可能通过活化JNK/c-Jun信号通路而调控骨肉瘤干细胞表型。本项目拟进一步：（1）采用微流控技术单细胞检测、慢病毒调控系统重编程以及体内成像技术等生物学手段，在原代骨肉瘤细胞、小鼠骨肉瘤模型及临床标本中逐级深入验证CDH4/JNK信号通路调控骨肉瘤干细胞表型并促进骨髓间充质干细胞重编程为骨肉瘤干细胞的关键性作用；（2）回顾性组织芯片（TMA）确认CDH4/JNK信号通路各组分的相互调控关系及其与临床预后的关系；（3）前瞻性实时定量芯片评估血浆CDH4可否预测临床预后。本项目的完成，可能为骨肉瘤的起始、进展和综合治疗提供新的思路。

骨肉瘤（Osteosarcoma）是儿童和青少年最常见的原发难治性恶性骨肿瘤，肿瘤复发和转移为临床预后不良的主要因素，而骨肉瘤预后不良的主要原因在于目前对骨肉瘤相关致病基因的生物学功能认识不足，尤其是在分子机制上的研究尤其欠缺。本研究通过分析骨肉瘤临床标本和骨肉瘤细胞株中CDH4基因的DNA状态（扩增、正常拷贝数或者缺失），分别使用基因表达图谱（GXA）和蛋白印迹（Western Blot）方法发现高度恶性和高侵袭转移能力的细胞株其CDH4 mRNA和蛋白水平均为高表达状态，CDH4的高表达与骨肉瘤肺转移及其不良预后相关。进一步功能实验发现CDH4通过该正向调控骨肉瘤细胞克隆形成和肉瘤球（sarcopshere）形成能力以及无锚定生长能力，并且可调控肿瘤干细胞标记物的表达；且CDH4可诱导钙粘蛋白转换（cadherin switching），敲低CDH4促进骨肉瘤细胞向正常成骨细胞分化，而过表达CDH4则导致骨肉瘤细胞去分化（De-differentiation）。 CDH4正向影响骨肉瘤细胞迁移和侵袭能力，这与其调控MMP1有关。最后筛选相关信号通路，发现CDH4正向调控p-Thr183/Tyr185-JNK和p-ser63-c-Jun的含量，敲低CDH4可导致AP-1转录活性降低。在CDH4敲低的稳定细胞株中外源性表达c-Jun可恢复JNK/c-Jun信号通路相关基因的表达。因此，本研究发现了CDH4在骨肉瘤中发挥癌基因的功能，并在调控阻碍骨肉瘤细胞向成骨细胞进一步分化而维持骨肉瘤干细胞特性过程中扮演重要地位，CDH4可能是与骨肉瘤肺转移及其不良预后相关的新的分子标志物，靶向CDH4/JNK/c-Jun分子通路可能是治疗骨肉瘤新的治疗策略。