识别核仁素的G-四链体探针的构建与识别机理研究

Nucleolin is a multifunctional protein in eukaryotic cells, and highly expressed on the surface of tumor cells. It has been a drug target and a potential biomarker. G-quadruplex is a characteristic secondary structure of nucleic acids containing repetitive tandem guanines. Putative G-quadruplex-forming sequences are highly prevalent in human genome. It is suggested that G-quadruplexes formed in gene might involve in the regulation of some physiological processes. Recently, we have found that some G-quadruplexes can bind to nucleolin. In addition, an anticancer agent targeting nucleolin, AS1411 that has entered phase II clinical trials is a DNA G-quadruplex. These imply that nucleolin may bind to G-quadruplex structures in gene to perform its multifunctional roles. Based on the above mentioned, we plan to investigate the relationship among sequence, structure and affinity to nucleolin of G-quadruplexes, and dig out the interaction mechanism between G-quadruplexes and nucleolin; to select new G-quadruplexes with high affinity and specificity to nucleolin and high resistance to nuclease degradation; to develop different molecular probes using the selected G-quadruplexes for the detection of tumor cells that highly express nucleolin on cell surface, for tumor imaging in the whole body, and for tracing of nucleolin in cells; to investigate the antiproliferative activity of the selected G-quadruplexes. Through the completion of the proposed work, we will reveal the molecular action mechanism and biological function of G-quadruplex structure in gene and nucleolin; obtain new diagnostic reagents for cancer and new methods for the nucleolin detection in cells; and discover new anticancer drugs.

核仁素是真核细胞中重要的多功能蛋白，在很多肿瘤细胞表面高表达，已成为重要的药物作用靶点和可能的疾病标志物。G-四链体是由富含G碱基的序列形成的特殊核酸二级结构，基因中这种结构的形成可能涉及重要生理过程的调控。我们最近发现核仁素与多种G-四链体分子结合，而一个靶向核仁素的抗肿瘤药物AS1411也是G-四链体结构，提示核仁素可能与一些G-四链体结合而参与对细胞的多重调控。基于此，本项目拟开展G-四链体分子与核仁素结合的构效关系和识别机理研究；同时筛选与核仁素结合力强、特异性好、核酸酶抗性高的G-四链体分子；以此构建不同的分子探针，分别用于表面高表达核仁素的肿瘤细胞的检测、肿瘤活体成像以及细胞内核仁素的示踪；研究这些G-四链体分子的肿瘤细胞抑制活性。通过上述研究阐述核仁素与G-四链体的分子作用机制和生物学功能；发展新的肿瘤诊断试剂和活细胞中核仁素探测新方法；发现新型、高效的G-四链体抗肿瘤药物。

G-四链体是由富含G碱基的序列形成的特殊核酸二级结构，广泛存在于基因组中，这种结构的形成可能涉及重要生理过程的调控。文献报道G-四链体可结合核仁素，其中G-四链体AS1411与肿瘤细胞膜上核仁素结合，被当做核仁素的核酸适配体广泛用于肿瘤的靶向治疗和分子成像，且作为抗肿瘤药物进入二期临床研究。在本项目早期，我们在进行G-四链体与核仁素结合的构效关系研究中发现，核仁素并不是G-四链体（包括AS1411）的主要靶标，且AS1411的抗肿瘤作用并不是通过结合核仁素引起。为了发展新的识别肿瘤的分子探针，了解G-四链体的分子结构与功能，我们以多种肿瘤细胞（包括高表达核仁素的细胞）为靶细胞，筛选识别不同肿瘤细胞表面蛋白的核酸适配体；设计合成G-四链体配基，研究G-四链体与不同靶标的分子识别机理；研究G-四链体分子的抗肿瘤作用的构效关系；发展基于功能核酸的分析方法。通过本项目研究我们获得了系列可识别活肿瘤细胞的核酸适配体，并构建了核酸适配体探针用于肿瘤活细胞成像分析，用核酸适配体探针发现了肿瘤细胞间连接结构可运输肿瘤耐药相关蛋白；合成了系列的G-四链体的小分子配基，发展了系列识别不同G-四链体结构的分子探针，阐明了G-四链体与小分子配基的识别机理，发展了G-四链体的分析方法用于水稻基因中G-四链体的分析，获得了探测活细胞线粒体自噬过程的荧光探针；首次提出G-四链体抑制肿瘤细胞增殖活性是由于其降解产生的鸟嘌呤化合物的选择性细胞毒性引起；建立了多种基于功能核酸的分析方法。这些研究为肿瘤分子诊断提供了探针和方法，为G-四链体结构与功能研究提供了分子工具，为G-四链体等核酸药物的设计、应用和安全性评价提供了依据。