桥粒蛋白DSG2 F531C突变致家族性ARVC的分子机制研究

致心律失常性右室心肌病（ARVC）是青壮年和运动员猝死的最常见原因之一。桥粒基因突变是其最常见的致病基因。课题组在一ARVC家系中发现DSG2 F531C突变，随后成功克隆DSG2基因并制备了真核表达载体，初步建立该突变转基因鼠。在此基础上，我们拟：1) 分别转染HEK293和HL-1细胞，研究该突变对DSG2蛋白成熟、细胞迁移和粘附的影响；观察PG蛋白和Cx43亚细胞定位的变化；探索Wnt/β-catenin信号通路改变。2) 鉴定已经制备的转基因小鼠，进一步通过耐力训练促进表型出现，对其进行表观遗传学分析，获取心肌标本对上述致病机制进一步深入研究。本研究如获成功，将有助于阐明DSG2 F531C 突变导致ARVC的机制，为该病的药物治疗或基因治疗提供新的思路。

致心律失常性右室心肌病（ARVC）是一种心肌进行性被纤维脂肪组织替代的遗传学心肌病，临床表现多为恶性室性心律失常和猝死，是青壮年和运动员猝死的常见原因。ARVC患者约10%携带有DSG2基因突变。先前我们对中国汉族家系ARVC患者基因筛查研究发现一个高度保守的DSG2F531C基因突变，但对DSG2F531C致ARVC的机制尚未阐明。我们提出了假说：DSG2F531C突变可能影响DSG2蛋白在闰盘区的定位，从而使其与PG的相互作用减弱，剧烈运动使心肌承受机械牵张力增加，促使PG从闰盘区域脱落进入细胞核，改变了Wnt/β-catenin信号通路而出现心肌的纤维脂肪化。. 在细胞水平上我们以心房肿瘤细胞系HL-1细胞为研究对象，使用RNA干扰技术，成功构建了四种ShDSG2重组质粒、转染细胞并获得稳转细胞株，筛选出对DSG2基因mRNA水平（71.67%，P<0.01）和蛋白水平表达（51.72%，P<0.01）的抑制效率最显著的ShDSG2-273组，结果发现DSG2沉默后的HL-1细胞凋亡显著增加，脂肪化（Adiponectin、PPAR-γ、C/EBP-α）和纤维化（Col1a1、Col1a2、Col3a1）相关基因在mRNA水平显著升高，超微结构显示细胞空泡样变性、线粒体肿胀和嵴消失，表现出符合人类ARVC的分子表型。DSG2基因沉默，激活AKT/β-catenin信号通路，免疫荧光显示PG的亚细胞定位无改变。. 之后我们建立了心脏特异表达的DSG2F536C转基因小鼠，分析DSG2F536C突变对小鼠心脏结构和功能的影响。突变型小鼠于6周出现心功能下降。心超结果显示与DSG2WT小鼠（n=4）相比，DSG2F536C小鼠（n=13）在左室收缩末期内径、左室舒张末期内径、室间隔厚度、射血分数等方面改变均无统计学意义。Masson染色显示小鼠左心室出现局灶性纤维化。心室肌细胞膜片钳结果显示DSG2F536C小鼠心肌细胞动作电位时程明显延长，钠通道失活延迟和钾通道电流密度下降，钙通道无改变。小鼠心脏免疫组化研究发现突变DSG2的定位异常，心肌闰盘区定位明显减少，免疫荧光发现闰盘区域PG蛋白显著下调而β-catenin代偿性上调。因此，DSG2F531C基因突变可引起ARVC类似的病理和电生理特性改变，其致病核心可能为突变DSG2细胞内定位的改变。