特异性富集和高选择性分离纯化目标蛋白质的复合磁性纳米粒子构建及分析

Magnetic nanoparticles with high quality, high specific selectivity, high adsorption capacity and multi-modal applications are proposed by the bioengineering field of protein separation and purification. In order to meet the requirements, we will construct a kind of composite magnetic nanoparticles Fe3O4@Au@NTA-Ni in the study. It will be successfully fabricated by synthesiizing core-shell magnetic nanoparticles Fe3O4@Au by seeded growth approach, followed by conjugating NTA and chelating Ni2+.By optimizing the conditions of protein separation,purification and on-beads refolding, the processing technology on target proteins will be studied. By regulating and controlling the chemical compositions, crystal types, magnetic responses, sizes and shapes, size distributions, charges, et al., the impact of composite nanoparticles on protein separation and purification will be studied. Furthermore, the mechanism of them will be revealed from the molecular level. It will provide theoretical support for the realization of large-scale protein separation and purification.

针对蛋白质分离纯化对磁性纳米粒子提出的高质量、高特异选择性、高吸附容量和多功能化应用的要求，本项目拟通过种子增长法合成包裹密实的核壳结构Fe3O4@Au纳米粒子，采用NTA进行表面修饰并与Ni2+螯合，构建一种复合磁性纳米粒子；通过优化分离纯化及复性条件，探讨复合磁性纳米粒子对目标蛋白质的处理工艺；通过调节和控制化学组成、晶型、磁响应性、粒子大小和形状、粒径分布及荷电情况等因素，研究复合磁性纳米粒子对目标蛋白质分离效率的影响，在分子水平上揭示其与目标蛋白质的相互作用机制。本项目将对实现大规模蛋白质分离纯化应用提供理论支撑。

利用磁分离技术研究快速、高效的蛋白质分离纯化具有重要意义。本项目在前期实验基础的前提下，首先制备羧基化的Fe3O4纳米粒子，采用BSA使其表面巯基化，然后采用柠檬酸钠还原法制备Au纳米粒子，通过二硫键作用自组装形成核壳磁性Fe3O4@Au纳米粒子，利用3-巯基丙酸（MPA）使其表面羧基化，采用碳二亚胺法将螯合配体NTA偶联到羧基化的Fe3O4@Au纳米粒子上，并进一步与NiCl2螯合，制备出一种复合磁性纳米粒子。利用DLS、XRD、FT-IR、XPS、TEM、UV-vis、元素分析、磁滞曲线等对其形貌、纳米特性、磁性及化学结构等进行了表征。结果表明，所制备的复合磁性纳米粒子具有所希望的特征官能团和超顺磁性。该复合磁性纳米粒子成功实现了从细胞裂解液中高选择性分离纯化组氨酸标签蛋白质，收率和纯度均达到90%以上。通过改变蛋白质种类、吸附缓冲液pH值、蛋白质吸附时间、咪唑洗脱液的浓度等进一步优化分离纯化条件，并研究其循环利用次数对分离纯化效率的影响。结果表明，吸附时PBS缓冲液的pH在7.4-8.0时吸附量大，pH过高（＞8.0）或过低（＜7.0）时不利于吸附；吸附时间对吸附量有一定影响，2h时基本达到饱和吸附量；咪唑洗脱液的浓度（0.25-1.0mol/L）洗脱量较大，0.5mol/L左右时，目标蛋白的洗脱量最大；此磁性复合纳米材料循环使用6次仍然保持90%以上的分离纯化效率。本项目的开展和研究显著提高了蛋白质分离纯化能力，不仅使其能够更好地满足蛋白质组学研究的要求，而且生物医药领域的发展具有重要意义。