东北刺人参不定根反应器培养机制及抗氧化特性研究

Opolopanax elatus has distributed in Changbai mountain area with high application value,it is a kind of plants under state protection( category II).However，there are two problems during sexual propagation, these are the low percentage of setting and low rate of gemination. For asexual propagation such as cutting, the regeneration time of stock is long due to the feign death phenomenon has often existed, and propagation materials are also seriously inadequate because of the limiting plant resource. For wild plants, excessive picking has resulted in the resource endangered. According to the present situation, we will use air-lift bioreactor to culture adventitious roots (AR) and produce a great quantity of anti-oxidation compounds(flavonoids,polyphenol,and polysaccharides).During bioreactor culture, we will adjust the micro-environment in bioreactor, explore the factors affecting AR growth, confirm the relatives of substrate parameters (eg. EC) with AR biomass and with effective compounds contents, respectively. In order to analyse the abilities of anti-oxidation in AR, we will determine the activities of anti-oxidation in AR extractives (with alcohol and water), flovonoids, polyphenol or polysaccharides using chemistry and bioactive methods of in vitro evaluation. To verify the results of the in vitro evaluation, we will use the method with injecting AR extractive to mouse stomach to observe the mouse behavior and determine the biochemical parameters in blood and tissue of mice. Our study will provide a new method for further application of the endangered and rare resource in Changbai mountain-O.elatus.

东北刺人参主要分布在长白山区,具有极高的应用价值,为国家二级保护植物。天然生长的东北刺人参不仅结实率低，而且种子发芽率也低；扦插等无性繁殖有"假死"现象，需较长的恢复期，且因资源有限导致无性繁殖材料不足；野生资源，由于过度采摘，目前处于濒危状态。针对东北刺人参面临的现状，本项目依根细胞中有效物质合成能力强，代谢稳定的特点，拟利用气升式生物反应器短期内培养不定根获得大量抗氧化物质-黄酮、多酚和多糖。反应器培养时，通过微环境的调控，探明影响不定根生长因素，并探明底物电导率等参数与不定根生长和物质合成关系，为今后工厂化生产提供理论依据。通过对不定根醇或水提取物及从不定根中提取的黄酮、多酚和多糖的抗氧化活性的体外研究，明确与抗氧化相关的关键物质。用不同剂量的不定根提取物对小鼠灌胃后测定小鼠血液及相关组织的生化指标，进一步验证东北刺人参不定根的抗氧化能力。本研究为东北刺人参的开发利用提供一种新方法。

国家二级保护植物-东北刺人参在野生资源趋于濒危，人工栽培体系尚未建立的条件下，寻找一条新的原材料来源具有重要意义。本项目通过调控反应器微环境，大量培养不定根获取生物活性物质，为今后产品生产提供理论依据。研究发现气体分布器直径越大反应器内氧传递系数（kLa）越高，分布器直径为3.5 cm时，反应器内kLa比2 cm分布器的反应器高1.3 h-1。在反应器（3.5 cm气体分布器）不定根培养时，培养基加入3 mg/L的吲哚丁酸（IBA）时，不定根生物量高于其他IBA浓度，多糖、酚、黄酮及皂苷积累最多。培养基中加入的食用白糖与试剂蔗糖效果相似，在规模化生产中可用食用白糖代替高价的蔗糖；且糖浓度为50 g/L时，不定根的生物量及生物活性物质积累量最多。接种量影响不定根培养，接种量为5 g/L（鲜重）时，不定根生长和物质合成显著好于接种量2.5、7.5及10 g/L；通气量过多过少均不利于不定根生长，适宜的通气量为75 mL/min。对反应器培养期间不定根生长和物质合成动态进行研究的结果，发现0~15 d为不定根生长停滞期，15~40 d为指数期，40~50 d为静止期，50 d以后则是衰减期。物质合成动态表现为多糖含量在0~15 d，酚和黄酮含量在0~20 d范围内，随培养时期的增加而下降。之后，三种物质含量则随培养时期的增加而增加，30 d为峰值。30 d后，多糖含量不变，但酚和黄酮含量下降。为提高物质合成量，用不同诱导子处理了不定根，发现培养第40 d分别添加不同浓度的茉莉酸甲酯（MeJA）和水杨酸（SA）时，200 μM 的MeJA显著促进多糖、酚及黄酮的合成，而100μM的SA只对酚和黄酮合成有促进作用，对多糖无影响。普鲁兰多糖（PA）在在培养始期加入时最佳浓度为150 mg/L，而在培养40 d后加入时最佳浓度则为200 mg/L。诱导子处理时间影响物质积累，不定根培养40 d后用MeJA和SA处理4 d时多糖、酚及黄酮积累最多。三种诱导子中，MeJA诱导效果最佳，其最佳的使用方法是在反应器不定根培养30 d加200μM处理8 d。不定根中生物活性物质的含量高于植株根中的含量，且不定根具有良好的抗氧化特性。在相同浓度条件下，DPPH自由基清除能力、铁离子螯合力及还原力比植株根高。本项目的研究将为植物资源的保护、开发及应用带来极高的社会及经济价值。