酶催化的立体选择性色氨酸-beta-C-甲基化反应及其机理研究

Many natural products including streptonigrin, lavendamycin, maremycin, indolemycin, FR900452, etc., contain the beta-C-methyl tryptophan moiety. we found an enzyme cassette consisting of an aminotransferase, a methyltransferase, and a cupin protein in the process of the investigations of the biosynthetic pathways of streptonigrin and maremycin. This enzyme cassette is able to elaborately control the enzymatic synthesis of the (2S, 3S)-3-methyl tryptophan and (2S, 3R)-3-methyl tryptophan. On this basis, we intend to have studies (1) to elucidate the enzymatic mechanism of the beta-C-methylation of tryptophan catalyzed by the combination of aminotransferase and methyltransferase; (2) to clarify the enzymatic mechanism of the stereospecific synthesis of (2S, 3S)-3-methyl tryptophan and (2S, 3R)-3- methyl tryptophan by the different combination of an aminotransferase, a methyltransferase, and a cupin protein; (3) to reveal the enzymatic mechanism of the stereospecific synthesis of (2S, 3S)-3-methyl tryptophan and (2S, 3R)-3-methyl tryptophan by the direct catalysis of the methyltransferase and cupin protein. This study will not only provide new insights into the enzymatic stereospecificity, but also can guide the design of the asymmetrically chemical reactions.

许多天然产物包括链黑菌素、淡紫醌霉素、海洋霉素、吲哚霉素、FR 900452等，它们均含有b-C-甲基色氨酸结构单元。我们在研究链黑菌素和海洋霉素的生物合成机制的过程中，发现一个由三个酶（氨基转移酶、甲基转移酶和一个Cupin蛋白）构成的催化体系，可以立体选择性地控制(2S,3S)-3-甲基色氨酸和(2S,3R)-3-甲基色氨酸的生物合成。我们拟在此基础上展开研究：（1）建立氨基转移酶和甲基转移酶催化色氨酸b-C-甲基化反应的过程；（2）阐明这三个酶通过不同的组合方式控制(2S,3S)-和(2S,3R)-3-甲基色氨酸的立体选择性合成的机制；（3）揭示甲基转移酶与Cupin蛋白直接催化(2S,3S)-和(2S,3R)-3-甲基色氨酸合成的酶学机理。这项研究不仅可以加深我们对酶催化不对称反应理论的理解，而且可以指导不对称化学反应的设计。

自然界中有些天然产物含有(2S,3S)-beta-甲基色氨酸结构单元如FR900452和Maremycin，有些天然产物含有(2S,3R)-beta-甲基色氨酸结构单元如吲哚霉素，telomycin 和chaetoglobisins等，链黑菌素，链黑菌酮和淡紫醌霉素据报道是以(2S,3R)-beta-甲基色氨酸为起始原料合成的。我们以Maremcyin和链黑菌素为研究对象，从基因和蛋白质水平系统研究了(2S,3R)-beta-甲基色氨酸和(2S,3S)-beta-甲基色氨酸的生物合成机制。甲基转移酶MarI/StnQ1与氨基转移酶MarG/StnR共同作用催化从色氨酸合成(2S,3R)-beta-甲基色氨酸，而当未知功能蛋白MarH/StnK3加入甲基转移酶和氨基转移酶的反应体系则催化色氨酸产生(2S,3S)-beta-甲基色氨酸。MarH和StnK3被证实为异构化酶，并利用同位素标记底物和点突变研究初步探讨了它们的催化异构化的酶学机理。. 利用晶体衍射技术获得了甲基转移酶MarI与甲基供体SAM、MarI-SAM-Inpy (吲哚丙酮酸，甲基受体)、和MarI-SAH-beta-MeInpy (beta-甲基吲哚丙酮酸，甲基化产物)等复合物的晶体结构，揭示了MarI是一个二聚体，并且结合一个三价铁离子。两个组氨酸、吲哚丙酮酸、水和SAM的氨基与Fe3+形成的六配位，使Fe3+与酶的结合显著增强，这是第一个利用SAM的氨基参与螯合金属离子的甲基转移酶。通过这些结构的解析清晰地阐明了甲基转移酶结合底物的位点和催化甲基转移的机理。.此外，我们还发现催化异构化的酶MarH/StnK3还可以催化氯霉素类似物的酰基化反应，MarH/StnK3具有对酰基受体底物的R-立体专一性和对酰基供体底物的一定底物宽泛性。并且通过定点突变研究，初步揭示了它们催化酰基化反应的关键氨基酸残基。. 这些研究不仅第一次阐明了自然界中存在beta-甲基色氨酸两种构型形成的生物学基础，而且为大规模制备这两种构型beta-甲基色氨酸的生物催化途径。此外还发现了一类全新的Cupin蛋白，尽管只有大约100个氨基酸，但是可以同时催化异构化反应和氯霉素类似物的酰基化反应，丰富了这个家族的多样性。