磷酸酶PHLPP对巨噬细胞中TLR及RIG-I触发的天然免疫应答的调控及机制研究

TLR和RIG-I信号受到很多信号分子的正相或负相调控，使免疫系统维持适度的活化水平。磷酸酶PHLPP能使Akt去磷酸化，抑制其活化从而促进肿瘤细胞的凋亡。然而，PHLPP能否参与巨噬细胞中TLR及RIG-I信号通路的调控尚未报道。我们预实验结果显示：poly(I:C)刺激能显著上调巨噬细胞中PHLPP的表达；干扰PHLPP表达能显著抑制LPS、poly(I:C)和VSV诱导的I型干扰素产生，但对炎性细胞因子的产生无明显影响；过表达PHLPP能显著增强TRIF、RIG-I活化的IFN-β报告基因的活性，但不影响TRIF活化NFκB报告基因、MyD88活化IFN-β报告基因的活性，表明PHLPP能特异促进巨噬细胞中TLR及RIG-I触发的I型干扰素产生。本项目旨在揭示PHLPP对TLR及RIG-I触发的天然免疫应答的调控及其机制，丰富感染免疫的内源性调控机制，为感染性疾病的治疗提供新思路

本研究对参与调控TLR及RIG-I触发的先天免疫的丝/苏氨酸磷酸酶进行了筛选并对其功能和作用机制进行了研究。首先检测感染VSV的巨噬细胞中丝/苏氨酸磷酸酶mRNA表达水平的变化，对表达显著上升的磷酸酶，通过siRNA干扰其蛋白表达，观察对VSV诱导的I型干扰素产生的影响。通过上述筛选，发现降低丝/苏氨酸磷酸酶PHLPP（PH domain leucine-rich repeat protein phosphatase）的表达能显著抑制VSV诱导的I型干扰素的产生。同时，干扰PHLPP表达可以显著抑制LPS或poly(I:C)诱导的I型干扰素的产生，但对炎性细胞因子TNF-α、IL-6的产生无明显影响。另外，干扰PHLPP表达对CpG ODN诱导的I型干扰素及炎性细胞因子产生均无显著影响。过表达PHLPP可以显著增强LPS、poly(I:C)以及VSV诱导的I型干扰素的产生，而对炎性细胞因子TNF-α、IL-6的产生也无明显影响。在PHLPP基因敲除的小鼠腹腔巨噬细胞中，也获得类似的结果。小鼠腹腔注射LPS、poly(I:C)或者VSV后，PHLPP基因敲除小鼠血清中IFN-β水平较野生型小鼠显著降低，而炎性细胞因子水平无明显变化。同时PHLPP基因敲除小鼠的肝脏和脾脏组织中VSV的复制和病毒滴度较野生型小鼠显著增加。进一步实验表明PHLPP可以通过其LRR结构域直接与IRF3的C端相结合，然后通过其PP2C结构域使IRF3 Ser332去磷酸化，从而抑制Ser332磷酸化依赖的Pin 1参与的IRF3的泛素化与降解，维持IRF3的稳定。因此，我们的研究表明PHLPP选择性参与了巨噬细胞中TLR及RIG-I触发的I型干扰素产生的正向调控；维持I型干扰素产生信号通路的持续活化，提高小鼠对VSV感染的抵抗力。本研究表明PHLPP作为一重要的IRF3蛋白稳定的调节因子，维持了机体抗病毒免疫的强度和持续时间，揭示丝/苏氨酸磷酸酶PHLPP是机体抗病毒免疫机制中重要的组成成分。本项目已发表标注该基金资助和批准号的SCI论文两篇，分别为Proc Natl Acad Sci USA（2013;110:11097-102, SCI影响因子9.737, 第一作者)和Journal of Immunology (2013;190:1685-94, SCI影响因子5.52,共同第一作者)。