IL-27和EGF共调控CXCL5对肝癌微环境中抑制性免疫细胞的影响

In liver cancer microenvironment, chemokine CXCL5 as a potential therapeutic target could promote tumor growth and tumor metastasis. However, the molecular mechanism of regulation on CXCL5 is still unclear. Our previous studies have confirmed that EGF could activate PI3K/Akt, ERK1/2 and p38/MAPK signal pathway to increase the level of CXCL5 secreted from liver cancer cells. Our experiment also indicates that IL-27 could decrease the level of CXCL5 secreted of liver cancer cells, whose mechanism need further research. Besides, it’s reported that CXCL5 could recruit myeloid derived suppressor cells and regulatory T cells, mediating tumor immune escape. Thus we put forward the hypothesis: the co-regulation of IL-27and EGF on CXCL5 may influence the immune suppressor cells in liver cancer microenvironment. We will use mouse hepat 1-6 cells,mouse model of liver cancer, lentiviral vectors, flow cytometery, immunofluorescence and Western Blot technology. We will explore the molecular mechanism of the co-regulation of IL-27 and EGF on CXCL5 and their effect on the immune suppressor cells from molecular,cellular and animal level, aiming to enrich the role of microenvironment on the tumor growth and metastasis and provide new ideas for the treatment of liver cancer.

肝癌微环境中趋化因子CXCL5能够促进肿瘤的生长和转移，成为潜在的治疗靶点。然而调控CXCL5的分子机制尚不十分明确。我们的前期工作证实，EGF能够激活PI3K/Akt、ERK1/2、p38/MAPK信号通路，促进肝癌细胞分泌CXCL5。预实验则提示IL-27能够抑制肝癌细胞分泌CXCL5，具体机制尚待明确。此外，经研究证实，CXCL5能够募集髓源性抑制细胞、调节性T细胞，介导肿瘤免疫逃逸。因此，我们认为IL-27和EGF共调控CXCL5可能会对肝癌微环境中抑制性免疫细胞产生影响。为验证这一设想，我们通过小鼠肝癌细胞Hepa 1-6、小鼠肝癌模型，采用慢病毒载体、流式细胞术、细胞免疫荧光、Western Blot等技术，从分子、细胞和动物水平，探讨IL-27和EGF共调控CXCL5的分子机制及其对抑制性免疫细胞的影响，旨在丰富微环境对肝癌生长转移的作用与机理，进一步为肝癌治疗提供新的思路。

研究背景：肝癌微环境中CXCL5能够促进肿瘤的生长和转移，成为潜在的治疗靶点。然而对于调控CXCL5的分子机制尚不明确。我们前期研究证实，EGF能够激活PI3K/Akt、ERK1/2、p38/MAPK信号通路，促进肝癌细胞分泌CXCL5。预实验提示IL-27能够抑制肝癌细胞分泌CXCL5，具体机制不明确。.研究内容：（1）研究IL-27 对肝癌细胞分泌 CXCL5 的影响及其机制：采用IL-27 蛋白干预不同的人或鼠肝癌细胞株，设时间梯度和浓度梯度，检测CXCL5蛋白水平；IL-27干预肝癌细胞后，检测信号通路中关键蛋白的磷酸化水平；采用siRNA阻断信号通路，观察IL-27对CXCL5分泌的影响。（2）CXCL5对抑制性免疫细胞的影响：建立CXCL5干扰的鼠肝癌细胞和C57BL/6小鼠肝癌动物模型，观察细胞体外迁移侵袭能力和体内成瘤能力。（3）IL-27和EGF共调控CXCL5对肝癌生长的影响：建立小鼠肝癌模型，分别采用IL-27蛋白和/或EGFR抑制剂干预，观察肿瘤生长情况，并用流式细胞术检测调节性B细胞、调节性T细胞所占细胞比例，采用ELISA检测相关免疫细胞因子的表达。.重要结果及数据：（1）IL-27抑制肝癌细胞分泌CXCL5且具有浓度和时间依赖性；IL-27干预后细胞内STAT1磷酸化水平升高最为明显；通过siRNA方法阻断该信号通路，发现IL-27抑制CXCL5分泌的作用被抵消。（2）建立CXCL5干扰稳转鼠肝癌细胞，收集细胞上清液进行迁移和侵袭实验，CXCL5干扰组较对照组迁移和侵袭细胞数明显下降，差异有统计学意义（P<0.001）；CXC5干扰后的小鼠肿瘤体积明显减小，且肿瘤组织中的Foxp3+T细胞和F4/80细胞较对照组均下降。（3）采用Hepa1-6细胞株皮下注射C57BL/6小鼠，分别用EGFR抑制剂和（或）IL-27蛋白腹腔注射，结果示EGFR抑制剂和IL-27联合干预组的肿瘤体积最小（p<0.01）。ELISA结果提示联合干预组小鼠外周血中相关免疫抑制性细胞因子IL-10、IL-35、TGF-β的表达均降低，流式细胞术结果提示联合干预组调节性B细胞、调节性T细胞所占细胞比例最低。.科学意义：IL-27和EGF对CXCL5的共调控作用使得IL-27和EGFR抑制剂联合治疗在小鼠肝癌动物模型中显示出一定的治疗效果，为后续肝癌治疗提供新思路。