气体信号分子硫化氢对椎间盘退变的影响及作用机制

Intervertebral disc degeneration disease is a common reason of low back pain,and its pathogenesis is not clear.Whether the gasotransmitter of hydrogen sulfide existing in the nucleus tissue of disc is not reported.We found that the rat nucleus pulposus cell expresses cystathionine β-synthase(CBS) and cystathionine γ-lyase(CSE).Therefore,we suppose that hydrogen sulfide exists in the interverbral disc,and it maybe exerts an influence on intervertebral disc degeneration(IVDD).Our topic for study:①the relation of expression of CBS and CSE with the degree of IVDD;②establishment of IVDD animal model and primary culture of nucleus pulposus cell,treating with different concentration of hydrogen sulfide and inhibitor of hydrogen sulfide synthetase,DL-propargylglycine(PPG),detecting the apoptosis of nucleus pulposus cell,alteration of extracellular matrix,and elucidating the influence and mechanism of action on IVDD.

椎间盘退变性疾病是临床上常见的引发腰背痛的顽疾，其发病机制尚不明确。新型气体信号分子硫化氢是否存在于椎间盘髓核组织中及其是否在椎间盘退变过程中起作用目前国内外尚无报道。既往课题组在研究中发现体外培养的大鼠髓核细胞表达硫化氢内源性合成酶胱硫醚-β-合成酶（CBS）及胱硫醚-γ-裂解酶（CSE），并对髓核细胞凋亡其调节作用。因而，我们假设气体信号分子硫化氢存在于椎间盘组织内，并可能随椎间盘退变过程而发生变化，对椎间盘退变产生影响。为此，本课题：①研究椎间盘退变（IVDD）患者椎间盘组织中CBS及CSE的表达与椎间盘退变程度的关系；②建立不同时间组IVDD动物模型并原代培养人退变间盘髓核细胞，给予不同浓度外源性硫化氢供体硫氢化钠及内源性硫化氢合成酶抑制剂炔丙基甘氨酸（PPG）干预，观察髓核细胞凋亡，细胞外基质等的变化，以阐明H2S对间盘退变进程的影响和作用机制。

本课题主要分为三个部分：.第一部分：将20只新西兰大白兔分为假手术组和实验组，术后三周全部处死。采用HE染色研究椎间盘组织病理学变化，采用Realtime-PCR法研究IIa型胶原mRNA及Aggrecan mRNA相对表达量，对椎间盘退变模型进行鉴定。证实针刺纤维环损伤椎间盘退变模型是一种可复制的用于椎间盘退变研究的动物模型。.第二部分：将建立椎间盘退变模型的30只新西兰大白兔分为实验3周组﹑实验6周组及实验12周组，分别在术后3周﹑6周﹑12周全部处死。采用HE染色研究椎间盘组织病理学变化，采用Realtime-PCR法研究IIa型胶原mRNA及Aggrecan mRNA相对表达量。采用免疫组化及Western blotting法检测硫化氢合成酶CBS和CTH在髓核细胞内的表达变化，用敏感硫电极法测定各组硫化氢产率反应内源性硫化氢合成酶活性。采用Western blotting法检测抑制细胞凋亡蛋白Bcl-2﹑凋亡执行蛋白Caspase 3作用底物蛋白PARP﹑促凋亡蛋白Bax表达变化。证实针刺纤维环损伤椎间盘退变模型中，随着椎间盘退变的加剧，细胞凋亡相关蛋白与内源性硫化氢体系表现出同步的变化趋势。.第三部分：体外培养正常3月龄新西兰大白兔髓核细胞传代至第3代进行下一步实验，首先给予TNF-α(50ng/ml)和不同浓度外源性硫化氢供体硫氢化钠处理，培养24小时后采用CCK-8法检测各组细胞活力，选取对髓核细胞活力影响最大的硫氢化钠浓度进行下一步的实验；再将髓核细胞按处理方法不同分为6组：正常对照组﹑外源性硫化氢供体硫氢化钠（NaHS）处理组﹑内源性硫化氢合成酶抑制剂（PPG）处理组﹑TNF-α处理组﹑TNF-α+PPG处理组﹑TNF-α+NaHS处理组。采用免疫荧光染色检测CBS及CTH在正常未处理髓核细胞内的表达。采用Western blotting法检测抑制细胞凋亡蛋白Bcl-2﹑凋亡执行蛋白Caspase 3作用底物PARP蛋白﹑促凋亡蛋白Bax表达变化，并检测Caspase 3活性。证实原代培养正常椎间盘髓核细胞实验提示外源性硫化氢可以部分拮抗TNF-α诱导的髓核细胞凋亡。