磷酸化蛋白质组选择富集结合质谱分析新方法研究及在长柄扁桃抗逆机制研究中的应用

Phosphoproteome plays an important role in regulation of biological function. Selective enrichment strategy is essential prior to mass spectrometry due to low abundance of phosphoproteins, weak signals of phosphopeptides and signals suppression by non-phosphorylated peptides. Immobilized metal ion affinity chromatography (IMAC) materials have been common used for selective enrichment of phosphoproteins or phosphopeptides from complex mixtures, and mixed/hybrid IMAC materials contained different metal ions have been capable of providing a whole phosphoproteome. Covalent organic frameworks have a superior potential as IMAC solid-phase matrix because of its permanent porosity with high specific surface areas. In this research, a series of covalent organic frameworks-based IMAC materials for phosphopeptides will be prepared, and a new method of selective enrichment combined with Mass spectrometry for phosphoproteome will be exploited. Subsequent works will focus on phosphoproteomes analysis of Amygdalus pedunculata Pall, and devote to revealing the signaling networks and response mechanisms under abiotic stress. The successful implementation of this program will establish a new method of selective enrichment combined with Mass spectrometry for phosphoproteome, offer potential candidates for breeding and cultivation of Amygdalus pedunculata Pall, and add some extra power to desertification control of northern China.

磷酸化蛋白质组在生物功能调控中发挥重要作用，但磷酸化蛋白含量低，其酶切肽段的质谱信号弱且受到非磷酸化肽段的信号抑制，因此选择性富集策略是磷酸化蛋白质质谱分析的前提。固定金属离子亲和材料广泛用于质谱分析前磷酸化蛋白质/多肽的选择性富集，包含多种金属离子的混合/混杂固定金属离子亲和材料可显著提高磷酸化蛋白质组覆盖率。拥有高比表面积永久多孔结构的共价有机骨架材料在作为该类材料固相基质方面表现出潜在的可能性。因此本课题拟制备系列用于选择性富集磷酸化多肽的以共价有机骨架材料为基质的混合/混杂固定金属离子亲和材料，建立磷酸化蛋白质组选择富集-质谱分析新方法，并藉此进行长柄扁桃磷酸化蛋白质组研究，揭示长柄扁桃干旱低温胁迫下的信息调控网络和分子应急机制。通过本课题的实施，将建立基于共价有机骨架亲和材料的磷酸化蛋白质组选择富集-质谱分析新方法，同时为长柄扁桃育种培植提供支撑信息，为我国北方荒漠治理增添动力。

磷酸化蛋白质组在生物功能调控中发挥重要作用，但磷酸化蛋白含量低，其酶切肽段离子化效率低且易受到非磷酸化肽段的信号抑制，因此选择性富集策略是磷酸化蛋白质组学分析的前提。本项目制备了系列用于磷酸化肽段选择性富集的新型固定金属离子亲和材料，建立了磷酸化蛋白质组选择富集-质谱分析新方法。制备出2种基于钛离子的IMAC新材料，可实现对磷酸化蛋白质组的高选择性富集和质谱鉴定，负载量最高达100 g mg-1，灵敏度最低至4 fmol，复杂样品分析结果均远高于经典DHB/TiO2法。研制了2种制备简便、易于分离、高效稳定的固定化酶反应器，酶切5分钟的BSA序列覆盖率（84%、89%）明显高于12小时传统溶液酶切（75-76%），用于长柄扁桃幼苗和种仁蛋白质组酶解，分别鉴定到2833和1200种蛋白质，优于传统溶液酶切，并从中发现了一些与长柄扁桃抗逆性相关的蛋白。发展了3种高灵敏的N-糖肽亲水选择性富集新材料，并应用于糖基化肽段的质谱分析和鉴定。采用基于质谱的非标记（Label-free）定量蛋白质组分析技术，对长柄扁桃、榆叶梅等5种扁桃属种仁蛋白样品进行蛋白质组鉴定及抗逆性机制分析，鉴定出长柄扁桃573种蛋白质，发现显著性表达差异的蛋白质为锌结合脱氢酶家族蛋白（AT5G16990）和硫氧还蛋白H型1（TRX1），这两种蛋白有望成为野生扁桃亚属植物种质胁迫响应的标志性蛋白种类。此外还开展了长柄扁桃种皮多酚鉴定及生物学功能研究、长柄扁桃叶代谢组学研究、长柄扁桃壳多孔复合碳材料的构筑及在超级电容器中的应用研究。本项目开发的新型纳米材料有望应用于磷酸化、糖基化蛋白组组学高通量的大规模分析，同时揭示了长柄扁桃对逆境胁迫可能的相应机制，有望为合理开发长柄扁桃提供新思路和新方法。.在该项基金的资助下，本项目共发表SCI论文28篇，项目负责人均为论文的通信作者。项目培养博士生3人，硕士生3人。项目组成员参与国际国内会议10余人次。