猪-猴胰岛移植的供体改造和耐受诱导研究

灵长类动物模型、供体基因改造、移植耐受诱导是异种移植研究的公认重要问题。课题组通过家猪-恒河猴异种胰岛移植，以延长胰岛移植物功能性存活时间为主攻方向，将这三个问题相结合进行探索：1）建立最为接近人类的恒河猴I型糖尿病实验模型，以该模型为主要实验工具开展体内研究，获得的结果更能够反映猪-人异种移植的真实情况；2）利用家猪胰岛体外制备的时机实施供体遗传改造，选择异种移植公认重要基因DAF和A20对胰岛细胞实现联合基因转导，观察移植物有功能存活时间，可能在减轻移植物体液排斥反应和炎性损伤方面获得突破；3）利用调节性T细胞具有的免疫抑制调节活性，分离扩增受体恒河猴CD4+CD25+Foxp3+Tregs，并与家猪胰岛联合输注移植，观察比较移植物存活时间、受体的免疫指标和病理生理指标变化，探索Tregs诱导胰岛移植免疫耐受的可能性和作用机制，若获成功可能在诱导异种移植耐受方面获得突破。

本项目按计划执行，取得以下重要研究成果：1）首次建立猴T1DM模型：以连续多次小剂量静脉注射STZ的方法成功诱导了自身免疫性恒河猴糖尿病模型；通过比较，证明了猪胰岛素的安全有效、经济实用性。2）新生猪胰岛（NPI）分化发育和基因改造研究：发现骨髓间充质干细胞（MSCs）可合成PDGF，进而活化NPI的PDGF-α受体，促进NPI的发育和功能。比较了不同病毒载体，发现腺病毒在较低感染复数条件下可达到对NPI较高感染效率。将CTLA-4Ig转和非转基因NPI移植入糖尿病猴肝内，给予免疫抑制剂，比较移植效果，结果CTLA-4Ig转基因能够提高异种胰岛移植的成功率，促进胰岛的长期存活。3）MSCs诱导猪-猴胰岛移植免疫耐受研究：结果表明猴MSCs能够改善缺氧引起的NPI代谢活性和功能降低，诱导抗缺氧基因表达，抑制淋巴细胞活化与增殖，有效保护高糖或炎症因子对胰岛细胞造成的应激损伤，维持胰岛的活性及功能。将猴MSCs与NPI联合移植入糖尿病猴肝内，能够明显增加受者血清C-肽含量，促进胰岛的发育成熟，提高胰岛移植的成功率。4）胰岛骨髓腔移植：比较恒河猴同种异体胰岛的骨髓腔和肝内移植治疗糖尿病的效果。结果提示骨髓腔移植手术操作简单，胰岛存活并保持功能时间更长，骨髓腔可能成为未来临床胰岛移植的适合位点。5）恒河猴凝血功能相关研究：发现在血糖控制不佳时血小板特异性的受体GP-VI参与的ROS产生和Ca2+流动明显增强，与糖尿病的高凝血状态相关。克隆得到猴血小板受体GP-Ib-α、GP-Ib-β、GP-IX基因编码序列，分析发现其与人的核酸和蛋白序列高度相似，但在相同浓度的瑞斯托菌素作用下猴血小板聚集能力明显较人低。6）CD83和CTLA4基因研究：在毕赤酵母中高效表达了融合蛋白hsCD83-Ig和mCTLA4-Ig，证明其能抑制淋巴细胞活化，有可能用于异种胰岛移植的免疫治疗。7） 恒河猴TNF-α蛋白研究：采用SUMO标签融合表达体系，合成TNF-α融合基因转入大肠杆菌表达，得到的天然样恒河猴TNF-α为三聚体蛋白，对TNF-α拮抗剂研发和评价具有重要的价值。8）恒河猴Tregs研究：天然Tregs在体外用抗CD3/CD28磁珠刺激后能有效扩增， TGF-β联合ATRA能诱导CD4+CD25-T细胞转化为CD4+CD25+诱导性Tregs，诱导第5天时，Tregs的纯度最高抑制活性最强