蛋白质中超快短程电子转移的动力学及机理研究

Electron transfer (ET) is ubiquitous in biology and essential to a variety of biological activities such as converting chemical energy and catalyzing enzymatic reactions. Various experiments examining long-range (>10 Å) ET have been designed and conducted, and theoretical models based on the original Marcus theory were developed. Typically, these ET dynamics are in equilibrium with local environments, occurring on time scales of nanoseconds or longer. However, when the donor-acceptor separation is<10 Å, the ET dynamics become nonequilibrium with local environment fluctuations, occurring ultrafast in the range of femtoseconds to hundreds of picoseconds. In this proposal, as part of our enduring efforts to elucidate the molecular mechanism of ultrafast nonequilibrium protein ET in the short range, we propose to carefully design the protein systems and systematically change the donor-acceptor distance from 3 to 10 Å, maintaining the constant driving force, in two model systems of Desulfovibrio vulgaris and Anabaena flavodoxin. We use the intrinsic tryptophan as the electron donor and the cofactor flavin as the electron acceptor, and design more than 10 mutants using site-directed mutagenesis by placing tryptophan at the desirable places. Using femtosecond spectroscopy, we will perform careful characterization of both the ET dynamics (both charge separation and charge recombination) by following the entire ET process through measuring the dynamics of the reactants, various intermediates and final products. We also examine the local environment dynamics and obtain relaxation correlation functions. With the obtained extensive data, we further explore the Sumi-Marcus “two-dimensional” model and get molecular insights into the coupling between the nonequilibrium ET dynamics and the protein environment fluctuations, as well as the detailed reorganization energies (λ0 and λi).

电子转移（ET）是生物体系中的普遍过程，对诸如化学能转化、酶催化等至关重要。对蛋白质中长程ET过程（电子供体-受体距离r＞10Å），各种实验和基于经典马库斯理论的模型已受到广泛研究，这种长程ET与局域环境处于平衡状态，发生在纳秒或更长时间。然而r<10Å时ET与蛋白局域环境处于非平衡状态，发生在飞秒至百皮秒时间范围内。本项目拟重点研究脱硫弧菌和项圈藻黄素蛋白中非平衡态超快短程ET动力学分子机理。使用色氨酸为电子供体，辅基黄素分子为电子受体，通过精确设计蛋白质供体突变体，使r在3-10Å间变化。采用飞秒光谱技术系统性研究短程ET过程，包括测量ET的反应物、各种中间体及反应产物的动力学。同时测量局域环境弛豫过程并获得相关的关联函数。通过丰富的数据积累，进一步探索苏米-马库斯二维ET理论，深入理解非平衡态ET与环境涨落等的耦合机制，并获得蛋白质的重要的重组能信息。

生物体系中电子转移反应普遍存在，与生理功能的实现息息相关。当电子供受体距离变短（电子供体-受体距离<10Å），电子转移速率发生在皮秒-纳秒（ps-ns）甚至飞秒（fs）量级，短程电子转移与蛋白溶剂化过程耦合在一起，导致了非平衡过程。.本项目以黄素蛋白为研究对象，其含有两个天然的电子供体（色氨酸W和酪氨酸Y），黄素辅基为电子受体。首先对蛋白的溶剂化过程进行定量表征，获得动力学驰豫时间（1-267ps），为后续理论计算提供定量研究基础。当蛋白在氧化态时，正向电子转移时间100-200fs，溶剂处于冻结状态，反向电子转移发生的时间尺度为1-2ps，基态振动弛豫过程为3-6ps，发现Y与FMN耦合作用更强，电子转移速率更快。当蛋白在半醌态时，发现正向电子转移和反向电子转移均发生在ps量级，这是因为还原电势变小，反应驱动力变弱，导致电子转移变慢并与环境强烈耦合。通过定点突变方法，改变使电子供体到受体距离从3到10Å，对电子转移进行调控，我们发现电子转移时间尺度位于fs-ns之间，并且部分W供体存在摆动行为，需用两个动力学衰减进行描述，可使用摆动（Wobbling）模型拟合。.本项目理论上发展了非平衡态超快电子转移新模型，引入描述溶剂化耦合程度的动力学因子gama ，当gama 趋近于0，电子转移速率远小于溶剂化速率时，此时溶剂处于冻结状态；当gama 趋近于1，当电子转移速率远大于溶剂化速率时，此时溶剂处于平衡状态；当gama 介于0到1之间，电子转移速率与溶剂化速率相当时，此时溶剂处于活化状态。将理论应用到氧化态和半醌态，研究发现，氧化态时电子耦合项在ET过程中占据主要地位；半醌态时，外部（溶剂）重组能不可忽略不计，导致了拉伸型ET衰减模式。.本项目的成功实施有助于深入理解短程电子转移与环境弛豫的耦合以及电子转移非平衡过程，对蛋白中短程和长程电子转移动力学的研究也至关重要。