野生大豆SnRK1激酶信号传导新途径及其对非生物胁迫抗性调控的研究

Wild soybean (Glycine Soja) possesses high tolerance to salt and alkali challenges. It is a model species for dissecting the molecular mechanisms of biological processes in abiotic stresses. Sucrose non-fermenting-1 kinases (SnRK) are directly involved in many signaling pathways including stress resistances. Exploring the upstream and downstream factors is the key to identifying novel SnRK signaling pathways. In this study, we will employ two yeast mutants to screen the cDNA library of wild soybean to identify the potential upstream activating and inhibiting factors of SnRK1. These factors will be further studied by biochemical, cytological and genetic procedures to confirm their in vitro and in vivo functions and to unveil novel SnRK1 signaling pathways, providing a new technology to systematically study the relevant pathways not only in plants but also in animals and humans. In the meantime, we will use high-throughput yeast two-hybrid technique to find the downstream interactors and potential substrates of SnRK1. In this project, we will focus on investigating how SnRK1 phosphorylates downstream TFs and HATs to regulate plant transcriptome and epigenetics, and further affects plant resistance to abiotic stresses. Furthermore, by using CRISPR, we will create the gene-engineered plants, providing the materials for in vivo verification of the above results and soybean breeding.

野生大豆具有很强耐盐碱能力，是研究胁迫分子机制的模式植物。蔗糖非发酵相关蛋白激酶(SnRK)是一类直接参与胁迫抗性等途径的激酶，探索SnRK激酶的上下游因子是揭示未知SnRK级联信号途径的关键。本项目首次使用2种酵母突变株系筛选野生大豆cDNA文库以获得SnRK1的上游激活和抑制因子，并通过生化、细胞学和遗传学方法研究这些因子在体内外激活或者抑制SnRK1激酶信号机理和植物相应性状，从而揭示SnRK1激酶新的信号途径。并为探索和研究其它同类激酶的上游未知因子开辟崭新的技术体系；利用高通量酵母二元杂交技术筛选SnRK1的下游互作蛋白并进一步确定其中的磷酸化底物，本项目重点对SnRK1激酶如何通过磷酸化与耐盐碱相关的TFs和HATs来调控转录谱和表观遗传学进而对植物抗性的影响，再结合CRISPR技术将SnRK1信号通路中关键基因进行敲除或增强表达，以确定其体内功能，并创造优异的大豆育种资源。

野生大豆(Glycine soja)是栽培大豆的近缘种，具有一定的经济价值和较高的抗逆特性，野生大豆基因组中含有四个GsSnRK1基因成员，但其功能还是未知的，本项目研究了野生大豆GsSnRK1蛋白激酶的生物化学、分子生物学和生理学以及在非生物胁迫信号传导中的功能。基因表达模式分析表明GsSnRK1基因响应盐碱和其它主要环境胁迫；为了进一步研究GsSnRK1的生物功能，我们利用酵母二元杂交技术筛选了野生大豆的cDNA文库，获得了一系列全新互作蛋白并用BiFC和Co-IP实验做了验证，然后对GsSnRK1的上下游因子做了深入研究。新发现的GsPKA和GsPP2CA作为正负调控因子在体内外均能够影响着GsSnRK1的蛋白激酶活性；GsERF7是响应盐碱胁迫的转录因子(TF)，实验证实了GsERF7和GsSnRK1的互作关系，磷酸化分析表明GsSnRK1通过磷酸化GsERF7的S36位点决定了其亚细胞定位和转录活性，Y1H和EMSA分析表明GsERF7通过结合GCC顺势作用元件影响着一系列下游基因的表达，将野生和突变的GsSnRK1和GsERF7基因组合在大豆毛状根中共转化并对植物进行一系列胁迫处理，结果表明GsSnRK1作为上游激酶，通过磷酸化GsERF7调控着植物的抗盐碱性；我们还发现GsSnRK1通过磷酸化乙酰化转移酶GsMYST1(HAT)决定着特定启动子区域组蛋白的乙酰化程度和相关基因的表达水平，首次揭示了SnRK1参与表观遗传学的调控；同时GsSnRK1结合但并不磷酸化GsSIE3泛素化连接酶，进一步分析表明GsSnRK1的结合直接决定了GsSIE3的泛素化能力和多个底物蛋白的稳定性；为了进一步筛选响应胁迫的GsSnRK1的磷酸化底物，我们将含有野生GsSnRK1(wt)和无激酶活性GsSnRK1(K49M)的拟南芥经过干旱和盐碱处理，提取总蛋白质做磷酸化质谱分析，得到了诸如剪切因子、甲基化转移酶等新的磷酸化底物，为进一步研究SnRK1的新功能打下了基础。我们已经按计划完成全部研究内容，研究成果发表在Plant Journal和Plant Cell Environment 等知名期刊上，为揭示植物抗逆的分子机制提供了新的理论证据，为创制新型农作物育种材料提供了重要的基因资源。