重组人肿瘤坏死因子β (rhTNF-β) 在大肠杆菌中的糖基化修饰及其抗肿瘤作用

在空肠弯曲菌中存在寡糖基转移酶PglB，PglB能够催化多种糖链转移至具有特定氨基酸序列的蛋白上，产生N-糖蛋白。PglB所转移的糖链必须是焦磷酸酯(PP-Und)连接的糖链，而在大肠杆菌O抗原合成途径中产生PP-Und连接的糖链。本申请中我们将PglB参与的N-糖蛋白合成途径与大肠杆菌O抗原合成途径相结合，在大肠杆菌内生产氮乙酰葡糖胺(GlcNAc)单糖基化的人肿瘤坏死因子β（TNF-β）。我们将选取大肠杆菌K12，对其进行基因工程改造，使其能够合成并积累GlcNAc-PP-Und，同时共表达PglB和人TNF-β，使其产生具有GlcNAc单糖基化的重组人TNF-β (rhTNF-β)。我们还将对GlcNAc单糖基化对rhTNF-β抑瘤活性的影响进行研究。为了提高rhTNF-β的抗肿瘤活性而在大肠杆菌中对其进行糖基化修饰，本项目是一个具有潜在应用价值的创新性的探索研究。

在空肠弯曲菌中存在寡糖基转移酶PglB，PglB能够催化多种糖链转移至具有特定氨基酸序列的蛋白上，产生N-糖蛋白。PglB所转移的糖链必须是十一异戊烯焦磷酸脂质载体(Und-pp)连接的糖链，而在大肠杆菌O抗原合成途径中产生PP-Und连接的糖链。本项目我们将PglB参与的N-糖蛋白合成途径与大肠杆菌O抗原合成途径相结合，在大肠杆菌内生产氮乙酰葡糖胺(GlcNAc)单糖基化的人肿瘤坏死因子β（TNF-β）。我们构建了pglB的表达载体pQE-80L-Kan/pglB，TNF-β的表达载体pMAL-p2X/TNF-β以及TNF-β羧基端含有糖基化位点序列的表达载体pET22b/TNF-β-glycotag。 通过在waal基因缺失的E.coli W3110共表达，获得了TNF-β蛋白，但经检测，没有发现TNF-β蛋白进行糖基化。我们把含有pgl基因簇的载体pACYC184/pgl和pET22b/TNF-β-glycotag载体共表达与E.coli BL21菌株，也没有获得糖基化的TNF-β蛋白。糖基化位点处于蛋白的柔性区域或暴露于蛋白表面、UDP-GlcNAc的浓度、处于周质腔的目的蛋白的浓度等因素影响糖基化效率。我们将继续优化条件，或改变目的蛋白为原核蛋白，在大肠杆菌中表达多糖蛋白偶联疫苗。