核糖体蛋白基因OsRPP0调控水稻育性发育研究

Rice male sterile lines are critical not only for hybrid breeding, but also for the understanding of floral organ development and morphology in rice. Recently, we screened a rice male sterile mutant named H-6231S. Using a modified MutMap method, we identified a mutation in an unreported gene OsRPP0, which encodes a 60S acidic ribosomal protein P0, responsible for the male sterility phenotype. However, the biological function of this gene in rice development remains largely unexplored. In this project, we intend to further verify the function of OsRPP0 mutation in mediating the male-sterile phenotype by targeted knockout of OsRPP0 using the CRISPR/Cas9 system, and by genetic complementation of the mutant phenotype using wild-type allele. We will examine the transverse sections of the mutant anthers at different developmental stages using light microscopy and transmission electron microscopy to obtain a detailed understanding of the developmental and cellular defects in H-6231S mutant. RNA in situ hybridization and real-time quantitative PCR will be performed to analyze the expression pattern and regulation pathway of OsRPP0 gene during rice anther development. Further study on the role of OsRPP0 will contribute to a better understanding of the mechanisms underlying rice male reproductive development.

水稻雄性不育不仅在杂交水稻生产上具有重要的应用价值，而且是研究植物花器官发育和形态建成的模式材料。前期我们筛选获得一个水稻无粉型不育突变体h6231，并利用改进的MutMap方法克隆到控制该雄性不育性状的基因OsRPP0，该基因编码核糖体P0蛋白，目前水稻中该类基因生物学功能研究尚未见报道。本项目拟采用CRISPR技术在水稻中定点敲除失活OsRPP0基因，进一步验证该基因突变体对雄器官发育的影响并观察其他表型变化；同时通过等位基因的遗传转化进行功能互补试验验证候选基因的功能，并利用石蜡包埋切片和染色技术以及透射电镜扫描技术进行细胞学观察，明确突变体发生花粉败育的时期及细胞学变化，从而确定OsRPP0基因的组织细胞学功能；采用原位杂交技术及实时荧光定量等方法研究目的基因的表达模式、基因表达调控情况，深入揭示OsRPP0基因调控水稻育性发育的分子机理，进一步丰富和完善水稻雄性不育基因调控网络。

酸性核糖体磷酸化蛋白P0（Ribosomal phosphoproteins P0，RPP0）是位于真核生物核糖体60S大亚基上的一种核糖体蛋白，相关基因在水稻中的功能目前尚未有研究。项目前期通过筛选获得一个水稻无粉型不育突变体h6231。花药细胞结构观察结果表明，突变体h6231花药绒毡层的细胞程序性死亡、乌氏体的形成和小孢子的发育均出现异常，最终导致突变体花粉败育。利用基于二代测序的SIMM法克隆到与突变体不育性状紧密连锁的突变位点，该位点位于8号染色体OsRPP0A基因第三外显子上，导致氨基酸替换突变。OsRPP0A基因编码一个核糖体P0蛋白。通过BLASTP序列比对发现，OsRPP0在水稻中存在3个高度同源基因，分别为OsRPP0A，OsRPP0B和OsRPP0C，三者蛋白序列同源性高达99%。RT-PCR分析表明，3个基因表达模式相似，在水稻根、茎、叶、花、种子等各组织器官中均有表达，但OsRPP0A基因表达丰度显著高于其他2个基因。分别敲除3个基因后发现，OsRPP0A基因敲除突变后，杂合体植株雌配子与雄配子发育正常，但突变体存在隐性纯合致死（胚胎致死）。同源基因OsRPP0B、OsRPP0C敲除突变体发育正常，没有出现上述表型。本项目初步解析了核糖体P0蛋白基因在水稻中的功能，为深入研究植物核糖体蛋白基因家族的分子机理奠定了基础。