代谢谱与山羊克隆胚胎及其供体细胞发育潜能相关性研究

Purpose: In present project, in vitro culture differences between goat primary transgenic cells and cells of transgenic cloned goats derived from the primary transgenic cells are compared. Development capacity of cloned embryos made by primary transgenic cells and sub-culture cells is also investigated. We aim to study the effect of continuous nuclear transplantation of transgenic cells on cloned embryo development. Meanwhile, the metabolomics of two kinds transgenic cells and cloned embryos are discussed. The relationship of metabolic information and embryonic potential development is further studied. We plan to establish the prediction model of embryonic potential development and provide new ideas for transgenic animal production. Content: (1) culture goat primary transgenic cells and cells from the transgenic cloned goat with the same generation, investigate the cell apoptosis and karyotype analysis, and study the activity and mutation rate of the two kinds of cells; use Raman spectrometer detection to test metabolism of two cells, analysis cell metabolism of different cells, and find the relationship between metabolic information and cell growth; (2) compare cloned embryos development ability using the two kinds cell as karyoplast donors, research epigenetic gene expression changes and embryo metabolic, look for the related biomarkers about development ability, and establish the prediction model of embryonic potential development.

目的：比较山羊原代转基因细胞和由此得到的转基因克隆山羊的体细胞体外培养差异，以及利用原代和继代转基因细胞做核供体生产克隆胚胎的体外发育能力，探索转基因细胞经过连续核移植后生产的胚胎发育潜能，同时深入研究这两种转基因细胞和克隆胚胎的代谢组学，探讨代谢信息与胚胎发育潜能的关系，建立胚胎发育潜能预测模型，为转基因动物的生产提供新的思路。 内容：（1）培养相同代数的山羊原代转基因细胞和转基因克隆山羊体细胞，通过凋亡检测和核型分析，研究两种细胞的活性和突变率；利用拉曼光谱仪检测两种细胞的代谢液，比较分析不同细胞的代谢图谱差异，研究代谢信息与细胞生长发育的关系；（2）观察两种细胞核移植后的胚胎发育能力，研究表观遗传基因表达变化和胚胎代谢谱，寻找与发育潜能相关的生物标记物，建立胚胎发育潜能预测模型。

体细胞核移植是转基因动物生产的理想方法，但供体细胞基因转染和药物筛选过程可能影响转基因克隆胚胎的发育潜能。因此，我们试图通过减少供体细胞的筛选过程，直接用成活的转基因克隆动物的细胞作为供体细胞进行核移植操作，以减少供体细胞在体外长期筛选对克隆胚胎发育的影响。本项目以3月龄山羊转基因成纤维细胞系（TFC细胞）及其作为供体细胞得到的3月龄转基因克隆羊成纤维细胞系（CFC细胞）为对象，通过定量PCR、免疫荧光、气相色谱-质谱联用技术等方法系统研究了两种细胞系的生物学特性及表观遗传差异，并通过体细胞核移植技术，构建克隆胚胎和继代克隆胚胎，研究其体外发育能力及克隆胚胎表观遗传特征，通过气相色谱-质谱联用技术检测胚胎的代谢谱，试图寻找出能预测胚胎发育潜能的特异性标记物。结果发现：（1）成功获得3月龄转基因克隆山羊成纤维细胞系，且其与TFC细胞有相似的增殖曲线。（2）通过基因组的甲基化水平分析发现，在CFC组中甲基化转移酶Dnmt1、Dnmt3b表达量均低于TFC组，而印记基因H19和IGF2R差异甲基化区域检测也发现，CFC细胞甲基化状态显著高于TFC细胞。（3）DNA甲基化的动态在克隆胚胎发育过程中异常，5mC去除异常及5hmC的持续降低可能是克隆胚胎异常发育的原因之一。（4）基于形态学评估的不同质量胚胎的代谢液中含有多种显著差异代谢物，这些代谢物多参与碳水化合物和氨基酸的代谢过程，可能与胚胎的体外发育潜能密切相关。（5）克隆胚胎和继代克隆胚胎体外发育能力无显著差异，表明CFC细胞表观遗传遗传并未影响克隆胚胎发育能力。(6)GC-MS检测发现，克隆胚胎和继代克隆胚胎培养液中差异代谢物较少，而与ICSI胚胎代谢谱差异较大。本项目的研究成果丰富了山羊体细胞核移植的理论基础，特别是结合不同供体细胞得到的克隆胚胎，分析供体细胞及其克隆胚胎的代谢特征，探讨影响克隆重构胚体外发育的内在代谢信息，对于改善动物胚胎体外发育的质量和提高转基因动物生产效率具有重要意义。