核酸酶MutL介导铜绿假单胞菌基因组大片段丢失从而耐受噬菌体的机制研究

Most bacterial genomes are continuously changing over time with respect to gene content and size, and several processes including deletion, duplication, and lateral gene transfer contribute to this genome evolution. The molecular mechanism of gene deletion includes homologous recombination and random deletion. Recently, our group reported a new deletion phenomenon: Pseudomonas aeruginosa phage resistance mutants deleted a large genomic fragment, which includes a gene involved in the biosynthesis of phage receptor. However, this deletion event exhibits three clear features: large genomic fragment deletions (200~300kb), a high frequency (10-6), and no site-specificity. To find out the deletion mechanism, we screened a P. aeruginosa transposon mutant library, and found that the fragment deletion is depended on mutL. Thus, this project aims to use genetic approaches to prove that MutL possess double stand DNA cutting function, which resulted in the genomic fragment deletion. The goal of this grant application is to provide some solid genetic and molecular evidence to a novel pathway leading to phage resistance by mutL-dependent chromosomal DNA deletion. The results of these studies will also provide new insight into bacterial genome deletion mechanisms.

基因的丢失、复制与水平转移是微生物基因组进化的重要动力，也是微生物遗传学关注的热点。细菌常常通过同源重组或随机方式丢失某些基因，以适应环境的改变。课题组近期报道了一种新的基因丢失现象，即铜绿假单胞菌（PA）可通过丢失大片段DNA而抵抗噬菌体感染，这种丢失具有概率高、片段大、位点非特异三大特点，其发生机制不清。通过转座子突变文库筛选，发现PA的核酸酶mutL突变后即不能发生大片段丢失。推测MutL在介导PA基因组大片段丢失从而耐受噬菌体中发挥重要作用。本项目拟通过基因敲除、回补等实验证实MutL在PA基因组大片段丢失中的作用，再通过克隆表达制备MutL重组蛋白，建立体外DNA剪切模型探索MutL切割双链DNA的能力及特异性识别位点，阐明MutL导致PA大片段DNA丢失的分子机制。该研究不仅有望阐明MutL的新功能，而且有助于揭示一种细菌耐受噬菌体的新机制，丰富我们对微生物遗传变异的认识。

本课题组近期报道了一种新的基因丢失现象：铜绿假单胞菌可通过丢失大片段DNA而抵抗噬菌体感染，因为丢失的片段中含有噬菌体受体编码基因galU。大片段DNA丢失具有高概率（~10-6）、大片段（200~300 kb）、位点非特异三个特点，这种丢失现象不符合同源重组和随机丢失的特点。为了寻找大片段DNA丢失的机制，我们通过转座子文库筛选，发现mutL突变后，铜绿假单胞菌不能产生红色耐受菌，也就说明其不能丢失大片段DNA。MutL是错配修复系统中的关键酶，具有单链DNA剪切活性，但其双链DNA剪切功能还有争议。因此，本课题将围绕MutL阐明其介导大片段DNA丢失从而耐受噬菌体时的机制。该课题的深入研究有望揭示一种新的MutL介导的基因丢失机制。. 目前已经满完成课题：证实MutL是介导铜绿假单胞菌基因组大片段丢失的关键因素，MutL能导致DNA双链断裂，断裂的DNA被非同源末端连接的关键酶LigD和Ku修复后，导致DNA的大片段丢失，从而耐受噬菌体。该研究不仅完整揭示了细菌通过丢失基因组片段从而耐受噬菌体的全新机制，更颠覆了人们对MutL功能的认识。MutL是错配修复系统的关键酶，具有DNA单链剪切功能，被认为是维持基因组稳定的因素。但是，该研究意外的发现，MutL还可以导致DNA双链的断裂和基因组大片段丢失。这一发现使得科研人员将重新审视细菌MutL的生理功能及其在进化中的作用。以上结果发表于Nucleic Acids Research（2018, doi: 10.1093/nar/gky160）。.申请人在研究铜绿假单胞菌噬菌体-宿主相互作用中，发现了一株dsRNA噬菌体phiYY，是目前测序的第7株dsRNA噬菌体，更是目前唯一一株能感染铜绿假单胞菌的dsRNA噬菌体。（2016, doi: 10.1038/srep38795.）。.申请人利用转录组和代谢组学技术，研究了铜绿假单胞菌噬菌体感染宿主的过程，发现噬菌体对宿主代谢的调控有两种途径。一是利用自身编码的代谢基因，如PaP1自身编码有胸腺嘧啶合成酶，而代谢产物检测发现噬菌体感染后，细菌内的胸腺嘧啶脱氧核苷显著增多。二是影响宿主代谢基因的表达，关闭或下调宿主的代谢基因。最终目的都是操纵宿主代谢，从而利于噬菌体的繁殖。（2017, doi: 10.3389/fmicb.2017.00548)