山羊痘病毒D5蛋白在病毒脱壳过程中的功能研究

Poxvirus DNA replication is triggered after uncoating involved in many viral-encoded proteins in the cytoplasm of infected cells. D5 protein is indispensable for the uncoating course of vaccinia virus. Goatpox virus (GTPV), an important animal poxvirus, is the causative agent of Goatpox that usually leads to huge economic losses worldwide. However, the precise mechanism of D5 in regulating the uncoating process of GTPV remains poorly understood. Therefore, the purpose of the study to identify the functions of D5 in regulating the uncoating process of GTPV will investigated by RNA interference, homologous recombination, indirect immunofluorescence assay and confocal microscopy observation. Then, a series of mutant viruses containing different functional domains of D5 protein will be constructed to determine its functional domains. This project will provide a theoretical basis for advancing the uncoating mechanism of GTPV, target therapy, and the prevention of the disease.

痘病毒侵入细胞后的脱壳过程是病毒复制的关键步骤之一，此过程涉及多种自身编码蛋白的参与，其中D5蛋白在痘苗病毒脱壳过程中起着重要作用。山羊痘病毒（GTPV）是危害严重的重要动物痘病毒之一，分析发现GTPV编码痘苗病毒D5的同系物，但有关D5在GTPV脱壳过程中的分子机制目前尚不清楚。因此，本项目拟以GTPV为研究对象，在RNAi干扰D5蛋白表达的基础上，构建病毒同源重组D5蛋白缺失株/回复株毒株，通过免疫荧光、激光共聚焦显微镜等技术研究D5蛋白对GTPV脱壳的影响，并进一步通过构建D5蛋白的功能域缺失毒株确定D5蛋白的功能结构域，明确D5蛋白在GTPV脱壳过程中的分子作用机制，进而为阐释GTPV的脱壳机制和阻断GTPV复制过程的药物设计提供理论依据。

痘病毒（Poxvirus）是已知最大的、最复杂的具有双层囊膜的双链DNA病毒，其感染宿主细胞后在胞浆内完成全部的增殖过程，需要经历侵入、脱壳、复制和释放等步骤。痘病毒的基因组通常是团缩在一个高度稳定的衣壳（capsid）中，并且其基因组在衣壳内被高度浓缩。衣壳能在适当的时间和位置被内在的环境所解离，随后病毒基因组能够快速释放到细胞质中进行复制因此，脱壳是痘病毒完成整个生命周期中的关键步骤之一。首先VACV吸附并侵入宿主细胞后，先在吞噬泡内去除外膜；其次吞噬泡破裂，早期蛋白开始转录，如E9、B1、D5、G5、I3等蛋白，其中D5蛋白参与了病毒的脱壳过程。D5蛋白具有NTP酶活性，其N端含有真核生物的引发酶活性域，C端含有III型超家族解旋酶域，C端的结构域具有AAA+ ATPase的功能，能够降解VACV衣壳，进而引起VACV基因组的释放与复制。.目前国内外对羊痘病毒D5蛋白参与病毒脱壳的研究尚属空白。因此，阐明D5蛋白在GTPV脱壳中的作用机制，对于从分子水平阐明GTPV感染与致病机制、深刻理解病毒与宿主细胞相互作用以及研制有效的抗病毒药物都具有重大的理论与实践意义。鉴于此，本项目拟以RNA干扰、基因重组、实时荧光定量PCR等技术研究D5蛋白在GTPV脱壳过程中的作用，为揭示GTPV的脱壳机制以及致病机制奠定基础。本项目分析并克隆了羊痘病毒D5基因，构建了其过表达细胞系，通过RNAi干扰技术抑制D5以后，观察了其对病毒核酸、病毒蛋白以及病毒产量的影响。但是由于D5缺失病毒没有拯救成功，尚需进一步对D5与羊痘病毒的脱壳之间的关系进行更深入的研究。