克雷伯氏菌氧化还原电位响应的分子机制

利用氧化还原电位(ORP)对兼性厌氧微生物发酵过程进行调控，是近年来快速发展的一项重要技术。然而，ORP如何影响微生物胞内代谢反应，微生物又如何适应环境ORP变化，目前尚缺乏系统深入的认识。申请人在前期研究Klebsiella oxytoca厌氧发酵的过程中，获得3株生理性状发生较大改变的突变株（分别是抗氯化锂突变株YMU1、具有NADH再生能力的工程菌OF-1及乙醇途径阻断的工程菌DA-1HB）。已发现这些菌株及野生菌M5al具有不同的最适ORP范围，且代谢表型差异明显。本项目拟以这4株菌为模型，通过比较蛋白质组学分析，研究同一ORP条件下4株菌的胞内蛋白质表达和修饰等差异，发现与ORP响应相关的分子基础；进而研究不同ORP条件下胞内蛋白质组的变化，探索菌株如何通过胞内蛋白质表达变化适应环境ORP的改变；最终在分子水平上揭示菌株对ORP响应的分子机制，为提高兼性厌氧菌发酵效率提供新认识。

利用氧化还原电位（ORP）对兼性厌氧微生物发酵过程进行调控，是近年来快速发展的一项重要技术，显著影响生物基化学品及生物能源等的生产效率。然而，ORP如何影响微生物胞内代谢反应，目前尚缺乏系统深入的认识。这种认识上的不足既限制了ORP控制策略的应用，也阻碍了根据ORP响应机制进行菌株工程改造的策略设计。本研究以兼性厌氧菌Klebsiella oxytoca为模式菌株，结合代谢通量分析与比较蛋白质组学研究，初步揭示了该菌响应ORP调控的分子基础：.（1）研究了不同氧化还原电位（ORP）条件下菌体生长和代谢的差异：当发酵体系ORP从-150 mV下调到-240 mV时，细胞的生长明显受到抑制，但1,3-丙二醇的产量显着增加。.（2）比较蛋白质组分析发现61个差异表达的蛋白主要参与碳水化合物代谢、细胞生物质合成和还原应激反应。催化1,3-丙二醇合成的假设蛋白—1,3-丙二醇还原酶（HOR）显着上调表达，而运输及生物质前体合成相关的蛋白质表达量下调。.（3）代谢通量分析发现低 ORP条件下甘油还原代谢途径通量显著提高，与比较蛋白质组分析的结果高度一致。更重要的是，发现调控不同ORP条件时，NADH再生途径通量发生显著变化，可使细胞在低ORP条件下获得更多还原力NADH。该结果与上述HOR显著上调表达一起，可能是导致菌体在低ORP条件下虽然菌体生长受到抑制，但1,3-丙二醇的产量显着增加的重要原因。.（4）通过将蛋白质表达谱在代谢网络中定位，并与代谢通量分布变化进行关联分析，对菌株如何响应ORP变化并影响代谢表型，获得了比较系统的认识，同时为进一步进行菌株优化提供了改造靶点。.（5）将上述ORP调控策略应用于另外一株厌氧菌——Clostridium acetobutylicum发酵体系，使目的产品丁醇批式发酵浓度达到16.8 g/L，比对照情况提高 40%左右。.（6）培养博士研究生2名；研究成果在TWAS-ROESEAP Symposium on Industrial Biotechnology（北京，2011）、IBS 2012（韩国，2012）、Metabolic Engineering IX（法国，2012）等国际会议上分别以会议报告、分会报告及poster形式展示，受到众多与会者的关注；发表SCI论文1篇，另1篇正在修回。