Flrt2调控眼胚裂融合的细胞和分子机理研究

Optic fissure is a transient opening during the process of retinal morphogenesis, which will be fully fused eventually. The failure in closing the optic fissure leads to coloboma, a cogenital eye disease that disrupts children’s vision. At present, the cellular and molecular mechanism governing the optic fissure closure is far from clear, which makes the study of the etiology of coloboam difficult. Flrt2 is a transmembrane protein rich in leucine repeats. Its family members are extensively involved in the development of the nervous system, but its role in retinal development has not been studied. Our previous studies have shown that Flrt2 is highly expressed in retinal progenitor cells located at both ends of optic fissure, and its conditional knockdown leads coloboma phenotype in zebrafish, suggesting that Flrt2 plays an important role in the process of optic fissure closure. Based on these results, we will study the function using morpholino injection and CRISPR/Cas9 system and explore the underlying cellular and molecular mechanisms of Flrt2 in regulating retinal development by combining the techniques of developmental biology, high-throughput sequencing and mass spectrometry in order to reveal coloboma and other hereditary retinal diseases etiology.

眼胚裂是视网膜形态发生过程中形成的暂时性裂隙，随着发育的进行将完全融合。眼胚裂融合障碍将在视网膜腹侧遗留永久性组织缺损，即为眼缺损。眼缺损是常见的先天性遗传性眼病，严重损害视功能。目前，由于眼胚裂融合的分子机制仍不清楚，使得其病因学研究更加困难。Flrt2是一个富含亮氨酸重复序列的跨膜蛋白，其家族成员广泛参与到神经系统发育过程中，但其在眼睛中的作用尚缺乏研究。我们的前期研究显示，Flrt2高度特异性表达于眼胚裂周围的视网膜前体细胞中，其功能缺失在斑马鱼中可引起眼缺损表型，表明其在眼胚裂融合过程中发挥重要作用。基于这些结果，在本项目中我们将以斑马鱼为模型，利用Morpholino基因敲降和CRISPR基因编辑技术对该基因进行功能研究，结合斑马鱼视网膜发育生物学、高通量测序、质谱分析等技术探讨Flrt2调控视网膜发育的细胞和分子机制，为揭示眼缺损和其它遗传性视网膜疾病的致病机理提供理论基础。

Flrt2 是Flrt家族的成员之一，具有10个富含亮氨酸的重复序列、纤连蛋白样 III 和具有短细胞内尾巴的跨膜结构域，在蛋白质-蛋白质相互作用、细胞粘附或排斥、迁移和生长等细胞行为中起着核心作用。以往对Flrt2的研究主要集中在脑、软骨发生、颅面和心脏等方面。而在胚胎发育过程中，Flrt2定位于哺乳动物的大脑中，与神经元迁移、突触形成和大脑神经回路形成有关。然而，目前有关Flrt2在斑马鱼视网膜发育中的表达和功能的报道甚少。因此，在本研究中，我们首先使用原位杂交（ISH）技术检测到了flrt2在视网膜中的高水平表达，并使用 CRISPR/Cas9基因组编辑构建了flrt2敲除（KO）斑马鱼系。通过实时荧光定量PCR检测flrt2的表达水平，结果显示其表达水平降低约60% 。而后采用BrdU标记、TUNEL分析、免疫荧光染色、荧光染料注射和RNA 测序，检测到了flrt2-KO斑马鱼眼睛的形态、细胞和分子事件的改变。我们发现flrt2-KO斑马鱼幼鱼眼发育异常，部分幼鱼出现小眼症，其视网膜祖细胞凋亡增加，通过RNA 测序的结果，我们推测这可能是由于crx、Neurod4、atoh7和pcdh8下调和Casp3a和Caspbl上调共同作用的结果。然而，flrt2的缺失对视网膜神经发育、视网膜前体细胞分化和增殖没有影响。