不同Bt毒素晶体蛋白对小菜蛾的防控效果及其作用机制研究

小菜蛾作为抗药性最为严重的农业害虫之一，对Bt毒素抗药性的上升严重制约了环境友好型Bt微生物杀虫剂和转Bt作物的使用，为了阻止或延缓小菜蛾抗药性的上升，保证作物的产量和品质，本项目拟采用多种Bt毒素对多个小菜蛾品系进行毒力测定，筛选出防治小菜蛾的最佳Bt杀虫剂及其最佳Bt毒素组合；同时研究不同Bt毒素作用于不同受体的具体分子机制，包括克隆Bt抗性和敏感小菜蛾钙粘蛋白和氨肽酶靶标受体基因，并构建重组表达载体，在昆虫细胞系中进行表达，利用ELISA测定表达蛋白同不同Bt毒素的结合情况；另外结合RNA干扰技术体系，将小菜蛾体内的这两种受体基因沉默，观察不同Bt毒素对功能基因丧失的小菜蛾的毒力及其生物学方面的变化，从分子水平上揭示小菜蛾抗Bt毒素以及Bt毒素作用于小菜蛾的真正机制。以上研究结果对于保证环境友好型杀虫剂Bt及转Bt作物的使用寿命具有重要的意义。

通过研究不同Bt毒素晶体蛋白对小菜蛾的防控效果及其作用机制，我们得出以下几个结论：.1）测定了不同Bt毒素对小菜蛾的毒力，获得了几个抗性小菜蛾品系。用Cry1Ac毒蛋白及Bt制剂分别对小菜蛾进行了室内抗性选育，获得了对Cry1Ac毒蛋白抗性倍数分别为245.2和24.43的两个小菜蛾抗性种群——美国抗性种群和深圳抗性种群，以及对Bt制剂抗性倍数为74.47的上海抗性种群，这就说明了不同的Bt毒素对于不同的小菜蛾种群毒力是不一样的；.2）克隆了靶标受体基因并将其在昆虫细胞系中表达。成功克隆出Bt抗性与敏感品系小菜蛾4个APN受体基因，并将APN5基因在昆虫细胞中成功表达。经SDS-PAGE、蛋白杂交和酶活性分析均表明，APN5基因在昆虫细胞中得到了成功表达，但是遗憾的是，经过测定亲和力，没有发现敏感品系和抗性品系之间的差异，可能是抗性倍数还没达到使得APN蛋白的亲和力发生变化，也可能其它受体发生改变导致抗性的变化；.3）CAD受体基因dsRNA的制备及其RNAi技术体系的建立。利用RNAi技术初步研究了小菜蛾钙粘蛋白基因的功能，在筛选了两个基因片段合成的dsRNA后，选取一段有效的dsRNA进行注射。注射后，对一些生物学参数的变化进行了统计。同时，在核酸和蛋白两个水平上进行检测，半定量RT-PCR的结果显示干扰前后钙粘蛋白基因的mRNA表达量有明显差异，基因被沉默；Western-blot结果显示，干扰后钙粘蛋白的表达量略有降低。干扰后的生测结果显示，RNAi后小菜蛾对Cry1Ac毒素的敏感性降低。这可能是RNAi将小菜蛾类钙粘蛋白沉默后，其与Cry1Ac的结合能力下降，对其敏感性降低，从而成活率提高。试验结果初步证明了小菜蛾钙粘蛋白与Cry1Ac的抗性有关，其为Bt的靶标受体。