栉孔扇贝性别分化关键基因的鉴定和功能分析

性别分化是发育生物学研究的永恒课题，但在海洋经济无脊椎动物尤其是贝类中的研究还很薄弱。本项目拟以栉孔扇贝为研究对象，在前期建立的性腺发生和分化模式基础上，采用表达谱差异分析技术对幼贝性腺分化过程中特异表达的基因和精卵巢差异表达基因进行高通量筛选，通过时空表达的real-time PCR分析鉴定关键基因，采用原位杂交和免疫组化技术建立其在扇贝性腺发生、分化和发育过程中的表达图式，结合RNAi沉默基因转录实验探讨基因功能，进一步通过靶基因分离初步建立关键基因与其它基因的表达调控关系。本研究有望获得一些扇贝性别分化的相关基因，并鉴定出调控网络中的个别关键基因，为阐明扇贝性别分化机理及实现生殖调控奠定基础。

本项目通过Solexa高通量测序获得了栉孔扇贝增殖期精巢和卵巢的表达谱数据，在此基础上筛选得到10余条特异或高表达的性别分化相关基因片段。克隆获得了boule、vtg、17β-HSD8、foxl2、wnt4、β-catenin和dax1基因的全长cDNA 序列，进行了相关生物信息学分析，通过RT-PCR、real-time PCR、原位杂交和免疫组化方法建立了上述基因及dmrt4基因在成体性腺周期和胚胎幼虫发育过程中的表达图式。其中，boule、vtg、foxl2和β-catenin高表达于卵巢，17β-HSD8、wnt4、dax1和dmrt4高表达于精巢。通过dmrt4干扰实验初步建立了成体扇贝RNAi实验方法，通过添加WNT信号通路抑制剂quercetin体外培养栉孔扇贝精巢细胞，发现β-catenin基因表达被抑制，证明了栉孔扇贝中存在经典的Wnt信号途径，同时dax1基因表达也随之下调，证明dax1基因为β-catenin基因的下游基因。上述性别分化基因的克隆和分析为阐明扇贝性别分化机理奠定了基础。