新型化学生物学工具的建立并应用于细胞自噬小体与其他细胞器互作网络的绘制

Currently, based on the autophagy-specific marker protein LC3-PE, there are two methods for the study of the inter-organelle communication of autophagosome and other organelles: LC3 antibody immunofluorescence labeling and GFP-LC3 fusion protein. The LC3 antibody recognizes both LC3-I and LC3-PE, and the cytoplasmic GFP-LC3 and vesicles containing GFP-LC3-PE cannot be distinguished under the microscope. The aim of this project is to develop novel chemical biology tools for the specific detection of lipidated protein LC3-PE for the study of the inter-organelle communication of autophagosomes and other organelles. Firstly, the project intends to prepare specific antibodies for LC3-PE. In combination with immunofluorescence techniques, the inter-organelle communication between autophagosomes and other organelles will be addressed. Secondly, the chemical probe alkyne-PE will be synthesized. Using metabolic labelling, bio-orthogonal reactions, and intramolecular FRET technology, LC3-PE will be specific detected and further dynamic interactions between autophagosomes and other organelles will be explained. The project is expected to develop a new chemical biology tools for the detection of LC3-PE and autophagosomes. The results of the project will reveal the role of inter-organelle communication in the formation of autophagosome and during autophagy processes.

目前，基于细胞自噬小体特异性标记蛋白LC3-PE，显微成像研究自噬小体与其他细胞器互作网络的方法有两种：LC3抗体免疫荧光标记和GFP-LC3融合蛋白。LC3抗体能同时识别LC3-I 和LC3-PE，显微镜下不能区分胞浆GFP-LC3和包含GFP-LC3-PE的微小囊泡。本项目拟开发多种新型的特异性检测脂基化蛋白LC3-PE的化学生物学工具，用于研究细胞自噬小体与其他细胞器互作网络。项目拟制备LC3-PE的特异性抗体；结合免疫荧光技术，显微成像研究细胞自噬小体与其他细胞器的互作；拟合成包含炔基的磷脂酰乙醇胺（alkyne-PE）探针，利用代谢标记、生物正交反应和分子内FRET技术，特异性检测LC3-PE，从而动态检测细胞自噬小体与其他细胞器互作。项目预期将开发新型的检测LC3-PE和细胞自噬小体的化学生物学工具，项目结果将揭示细胞器互作对细胞自噬小体的形成和细胞自噬进程的调节机制。

细胞自噬是真核细胞所特有的对细胞内受损细胞器及长寿命蛋白通过溶酶体途径进行降解的细胞生物学过程。自噬异常调节会导致一系列的疾病，例如衰老、癌症和神经退行性疾病等。因此，研究细胞自噬的分子机制，有助于拓展对细胞自噬的认识，进而为相关疾病治疗提供新的药物靶标和科学依据。目前，基于细胞自噬小体特异性标记蛋白LC3-PE，显微成像研究自噬小体与其他细胞器互作网络的方法有两种：LC3抗体免疫荧光标记和GFP-LC3融合蛋白。LC3抗体能同时识别LC3-I和LC3-PE，显微镜下不能区分胞浆GFP-LC3和包含GFP-LC3-PE的微小囊泡。本项目开发多种新型的特异性检测脂基化蛋白LC3-PE的化学生物学工具，深入细胞自噬调控机制及自噬小体的形成。主要取得以下研究成果：1、以脂基化蛋白LC3-PE为蓝本，设计和合成了脂基化蛋白LC3-PE特异的多肽，利用多肽抗原免疫动物，制备抗血清，并检测抗血清中抗体的特异性及其效价，研究结果显示获得的特异性识别LC3-PE的抗体效价较高；2、利用化学探针alkyne-PE孵育细胞，代谢标记胞内所有alkyne-PE修饰的蛋白，利用叠氮修饰的荧光染料生物正交标记alkyne-PE修饰的蛋白质；3、利用脂质探针17-ODYA代谢标记脂修饰蛋白，鉴定了一系列棕榈酰化修饰的自噬相关蛋白，并深入探究了其生物学功能和机制；4、成功建立新型的基于细胞自噬途径介导的靶向降解策略，并利用该策略特异性的靶向降解Tau蛋白和线粒体，为抗肿瘤和治疗神经退行性疾病的药物开发提供新的思路和途径；5、揭示Yersinia效应蛋白YopT水解宿主脂基化蛋白的作用机制奠定基础，为研发针对Yersinia的抗菌药物提供重要的参考。