桃cyp450-s 基因调节GA/ABA介导花芽休眠解除的机制研究

Dormancy is the main obstacle for regulation of budburst in fruit trees. In protected fruit production, the production period is directly determined by the dormancy process. Gene cytochrome P450-s (cyp450-s) promotes the decomposition of ABA and the synthesis of GA and plays important part in dormancy release. However, the detail role of cyp450-s in dormancy release is still lack of knowledge. In our previous research, cyp450-s was screened in the cDNA library of dormancy release for the first time and was found to be increased in expression during the dormancy release process. So it is speculated that the increased expression of cyp450-s maybe involved in dormancy release through the regulation of ABA decomposition and GA synthesis. In order to prove the hypothesis, full length and promotors of gene cyp450-s will be cloned and changes of cyp450-s expression during dormancy release will be determined in the study. Changes of ABA, GA and related gene expressions will also be examined following treatments of ABA, GA and CYP450-S inhibitor in order to analysis relationships between cyp450-s in dormancy release. Finally, functions of cyp450-s in dormancy release regulation will be verified by transgene experiments.

休眠作为限制果树萌芽期调控的主要因子,其解除期早晚直接影响设施果树扣棚时间的早晚，cyp450-s基因在休眠解除过程中发挥至关重要的作用，其确切机制尚未阐明。cyp450-s可促进ABA分解及GA的合成，但是通过何种途径导致休眠解除尚不清楚。本课题组首次在构建的休眠解除cDNA文库中筛选到cyp450-s基因，并发现随休眠解除cyp450-s基因表达量升高。我们推测cyp450-s表达增加与ABA的分解和GA的合成进而促进休眠解除有关。为证实该假说，本研究将克隆cyp450-s的全长基因及启动子，通过自然休眠过程中该基因的表达分析，初步确定cyp450-s与休眠解除的相关性；利用外源ABA、GA处理、CYP450-S的活性抑制剂处理，通过测定ABA、GA的含量和基因表达，分析cyp450-s与休眠解除的调控关系；最后通过转基因验证cyp450-s对休眠的调控作用。

休眠作为限制果树萌芽期调控的主要因子,其解除期早晚直接影响设施果树扣棚时间的早晚，本研究探讨了cyp450-s基因在休眠过程中的作用机理。试验以‘中油四号’油桃为材料，筛选了桃树基因组中调控ABA代谢的cyp450-s关键基因，检测ABA代谢关键基因在种子休眠以及芽休眠过程中的表达模式。克隆3个控制ABA分解的CYP707A基因家族成员，并诱导表达其相应蛋白，同时获得桃CYP707A家族3个基因的过表达拟南芥植株。主要结果如下：（1）ABA 调控花芽以及叶芽的休眠进程具有相似的代谢分子机制，并且 NCED 家族是调控芽休眠过程 ABA 合成的关键基因，在芽休眠诱导阶段具有重要的调节功能；CYP707A 家族调控芽休眠过程中 ABA 的分解代谢，参与调控芽休眠解除的进程。(2) 在桃种子发育期间，ABA 的大量合成诱导种子休眠，随着诱导 ABA 代谢相关基因的表达，说明这些基因表达水平的提高导致 ABA 含量的升高。(3) 在桃种子层积过程中，ABA 合成相关的关键基因表达量逐渐降低，但是 ABA分解代谢的关键基因 CYP707A 表达水平在休眠解除阶段逐渐升高，说明 CYP707A调控桃种子休眠解除的过程。(4) 通过比对 ABA 含量以及 ABA 代谢相关基因在芽休眠和种子休眠过程中的变化模式，结果说明 ABA 调控花芽以及叶芽休眠具有相似的分子调控网络，因此，ABA在调控种子休眠与芽休眠的代谢分子机制具有一定的结合点，但是其本质是不同的。(5)构建正义植物表达载体PBI121-PpCYP707A1、PBI121-PpCYP707A2、PBI121-PpCYP707A3，农杆菌介导转化拟南芥，同时转空载体作对照。经卡那霉素筛选获得若干再生植株，PCR 鉴定发现PpCYP707A1、PpCYP707A2、PpCYP707A3在拟南芥中成功表达。