MFAP5对基底细胞样乳腺癌的表达调控及其分子病理学研究

Our preliminary study indicated that there was markedly MFAP5 up-regulation in basal-like breast carcinoma(BLBC); It showed through our developed computer-assisted software that MFAP5, as multifunctional secreted protein, involved indirectly in the regulation of different protein kinases in BLBC. MFAP5 up-regulation promoted angiogenesis and benefited tumour cell survival, which is related with the poor prognosis.So the current study attempt to further study the MFAP5 regulation and its mechanism in both BLBC invasion and metastasis. Whether MFAP5 exerts its influence on cellular adhesion, motibility,invasion and epithelial-mesenchymal transition（EMT）in vitro will be studied by transferring MFAP5-expresssing plasmid or specific small interfering(siRNA), establishing low- or high- MFAP5 expression cell lines. In addition, the model of xenograft tumour in nude mice will be established in order to analyze MFAP5 influence on tumour growth and metastasis, cell proliferation and angiogenesis in vivo. Quantitative real-time PCR combined with immunohistochemistry, immunoblot and gene functional analysis will also be employed to explore the kinase signal pathways involved in MFAP5, the differential peptidomic profiles reflecting BLBC characteristics will be confirmed. In conclusion, this study will hopefully provide the theoretical basis towards BLBC target therapy.

我们的研究提示基底细胞样乳腺癌(BLBC)中MFAP5基因有明显上调；通过我们开发的软件分析提示，作为多功能分泌蛋白MFAP5，间接参与了各蛋白激酶通路的调控。体内外实验显示，MFAP5的上调促进肿瘤血管形成及瘤细胞生存；与肿瘤患者的不良预后明显相关。本课题拟进一步探讨MFAP5在BLBC侵袭转移中的调控及作用机制。通过转染MFAP5表达质粒或其特异小干扰RNA,建立MFAP5过表达和低表达BLBC细胞系，研究该基因在体外对癌细胞粘附、迁移、侵袭、上皮细胞间质转化等影响；建立裸鼠BLBC移植瘤模型，分析MFAP5在体内对瘤体生长和转移、细胞增殖及血管生成的影响；应用定量 PCR 芯片技术结合免疫组化、免疫印迹以及基因功能研究，深入探讨MFAP5作用分子机制以及MFAP5所参与的乳腺癌细胞的激酶信号通路，确定针对性反映BLBC细胞的特征差异表达基因。研究结果有望为BLBC靶向治疗提供理论基础

目前临床上对基底细胞样乳腺癌(BLBC)仍然缺乏有效治疗手段。为了解BLBC发生发展的病理机制，尤其决定其较差预后的关键基因或分子遗传学特点、有关信号通路是研究关键。通过我们开发的软件分析提示，作为多功能分泌蛋白MFAP5，间接参与了各蛋白激酶通路的调控；通过转染MFAP5表达质粒或其特异小干扰RNA，建立MFAP5过表达和低表达BLBC细胞系；应用定量PCR芯片技术结合免疫组化、免疫印迹以及基因功能研究；体外实验了解MFAP5的上调对肿瘤血管形成及瘤细胞增殖的影响；建立裸鼠BLBC移植瘤模型，分析MFAP5在体内对瘤体生长和转移、细胞增殖及血管生成的影响。层次聚类分析显示，BLBC可细分为3种 或 4 种亚型。BLBC 更多地涉及到局部粘附、细胞因子受体反应和 Jak-STAT 信号路径，也有其它基因包括FAK, ERBB 和其信号途径对BLBC的发展有重要作用；其MFAP5mRNA和FGF2基因表达呈正相关；MFAP5和它的结构相关基因MFAP2具有共同的交互蛋白FBN1 和FBN2。网络模型显示MFAP5 直接与FBN1, FBN2, FBLN1 和 MEGF6 有关，共同调节下游信号途径。MFAP5 在BLBC 与其它分子分型的乳腺癌有不同的差异表达并涉及到BLBC 的磷酸化事件；MFAP5可能是通过间接与EGFR和SRC发挥信号交互作用，SMAD2、 SMAD4、 DCN、 HBEGF 和 FGF2 可能涉及到BLBC中MFAP5与磷酸化事件的调节机制。故有可能MFAP5 的信号机制因肿瘤异质性而不同；MFAP5基因表达量显示BT20细胞中△Ct值表达量低，HS578T细胞中△Ct值表达量高，BT20和HS578T细胞均可表达MAGP2（即MFAP5）蛋白。MFAP5过表达载体构建，表明可获得测序正确的载体。MFAP5干扰载体构建后获得测序正确干扰慢病毒载体、过表达慢病毒和干扰慢病毒。靶细胞BT20和靶细胞HS578T侵染效果均达80%。采用干扰筛选后最优干扰慢病毒效率达81.3%。在慢病毒侵染BT20细胞后，MFAP5表达明显上调。慢病毒侵染HS578T细胞后MFAP5表达明显下调。以上结果对于了解MFAP5的作用分子机制及所参与的BLBC激酶信号通路，确定针对性反映BLBC细胞的特征差异表达基因有一定分子病理学意义；有望为BLBC靶向治疗提供理论基础。