βarrestin1通过PERK/eIF2α通路下调内质网应激抑制放射性肠损伤肠干细胞增殖的机制研究

Our previous study reveals that Intestinal stem cell apoptosis is the critical factor of radiation (IR)-induced intestinal damage (Liu ZH, et al. Am J Physiol- Gastrointest Liver Physiol 2014:G1033-43), but the effect of IR on intestinal stem cell proliferation remains to be elusive. Past studies have demonstrated that endoplasmic reticulum stress (ERS) can potentiate intestinal stem cell proliferation and also found that βarrestin1 (βarr1), a G protein receptor-associated adaptor protein, is importantly involved in ER process. We further found that IR promoted the expressions of βarr1, p-PERK and p-eIF2α in intestinal crypts of mice and inhibition of ERS decreased the proliferation index of intestinal crypts. However, the significance of mutual regulation between βarr1 and ERS on intestinal stem cell proliferation in IR-induced intestinal damage is still unknown. First, our future work is to explore the impact of down-regulation of βarr1 or inhibition of ERS on proliferation index of intestinal crypt in mice. Second, we will isolate and culture Lgr5 positive cells from Lgr5 konck-in mice and then, study the regulation of βarr1 on PERK when βarr1 is over-expressed in Lgr5 positive cells. Moreover, we will analyze the regulation of βarr1 on ERS-mediated intestinal stem cell proliferation though PERK/eIF2α pathway by down-regulating βarr1 expression or suppressing ERS. Finally, we will verify the above mechanism in clinical samples. The project is expected to provide the meaningful significance for clinical treatment in the future.

我们前期研究表明肠干细胞凋亡是放射性肠损伤的重要原因 (Liu ZH, Am J Physiol)，但放射线对肠干细胞增殖的影响仍知之甚少。既往研究表明内质网应激（ERS）的激活能促进肠干细胞增殖；衔接蛋白βarrestin1(βarr1)是参与ERS的重要蛋白。我们进一步发现放射线能提高小肠隐窝βarr1、p-PERK和p-eIF2α表达；抑制ERS可降低肠隐窝增殖能力，但βarr1与ERS互调控作用在放射性肠损伤肠干细胞增殖中仍不明确，本课题拟研究1)下调βarr1或抑制ERS对小鼠肠隐窝增殖的影响；2)用Lgr5敲入小鼠体外分离培养Lgr5+肠干细胞，通过高表达βarr1研究βarr1对PERK调控作用，同时低表达βarr1或抑制ERS来探讨βarr1通过PERK/eIF2α来调控ERS介导的肠干细胞增殖的机制；3)在放射性肠炎临床标本中验证此调控。本项目有望为今后临床治疗提供参考。

放射性肠损伤是盆腔和腹部肿瘤放疗后最常见的并发症。放射性肠损伤不仅制约放疗在肿瘤中的应用，同时严重影响疗效及患者的生活质量，缩短了患者生存期。因此，研究放射性肠损伤的发生发展机制具有重要临床意义。 我们既往研究揭示肠干细胞凋亡是放射性肠损伤的重要原因 (Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol, 2014, 307(11):G1033-43.)，肠上皮干细胞凋亡和增殖维持着肠上皮粘膜的完整性。这激发我们进一步探究放射线是如何影响肠干细胞增殖。在本基金支持下，我们研究发现，内质网应激相关蛋白-蛋白激酶R样内质网激酶（PERK）低表达时显著降低放射线损伤后肠干细胞增殖活动。利用反义寡核苷酸体内注射下调PERK，在Lgr5小鼠接受放射线照射后，PERK下调组其Lgr5阳性肠干细胞的数量、增殖生物标志物、Akt蛋白和生存率都显著下降，而其分化生物标志物明显升高（Experimental Cell Research. 2019;375(1):42-51）。这些结果证实了在放射性肠损伤中，PERK能够调控肠干细胞的增殖。进一步探究PERK调节放射性肠干细胞增殖的上游，我们发现G蛋白偶联受体相关蛋白β-arrestin1在放射性肠炎患者和放射性肠病小鼠的肠组织的表达都明显升高，我们利用β-arrestin1敲除小鼠和Lgr5小鼠制作放射性肠损伤模型，通过体内体外实验发现β-arrestin1敲除能提高Lgr5阳性肠干细胞增殖能力、肠隐窝再生以及小鼠生存率。但当抑制PERK/eIF2α通路时，β-arrestin1缺失所带来的保护作用会被抵消。以上结果证实了β-arrestin1通过PERK/eIF2α通路调控放射性肠损伤肠干细胞增殖（FASEB J. 2019；33(9):10165-10176）。上述研究为β-arrestin1/PERK/eIF2α信号分子作为放射性肠损伤新的治疗靶点提供了科学理论依据，为临床药物开发打下了坚实的基础。